[發(fā)明專利]一種人源堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、煙草葉綠體表達(dá)載體及生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510310239.3
• 申請(qǐng)日: 2015-06-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104946656B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邢少辰;蔡玉紅;王云鵬;韋正乙;仲曉芳;林春晶;張玉英;馬建;劉艷芝;孫卉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/82;C07K14/50;C07K1/34
• 代理公司: 北京卓嵐智財(cái)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 任漱晨

1.一種人源堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因，其特征在于，該基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種用于生產(chǎn)人源堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的煙草葉綠體表達(dá)載體，其特征在于，該載體表達(dá)框兩側(cè)序列分別為克隆自煙草葉綠體基因組中的部分16S核糖體RNA基因與異亮氨酸轉(zhuǎn)移RNA基因構(gòu)成的16S-trnI片段和丙氨酸轉(zhuǎn)移RNA基因與部分23S核糖體RNA基因構(gòu)成的trnA-23S片段；在靠近trnA-23S片段的是權(quán)利要求1所述的目的基因bFGF基因，其由葉綠體特異性融合啟動(dòng)子PrrnPclpPrbcL驅(qū)動(dòng)，并由煙草葉綠體終止子TpsbA終止，構(gòu)成目的基因表達(dá)框；而靠近16S-trnI片段的分別是作為報(bào)告基因的綠色熒光蛋白基因GFP和作為篩選標(biāo)記基因的壯觀霉素抗性基因aadA，依次位于煙草葉綠體啟動(dòng)子Prrn與煙草葉綠體終止子Trps16之間，構(gòu)成多順?lè)醋拥谋磉_(dá)框；命名為pWX-Nt03。

3.一種攜帶并可擴(kuò)增權(quán)利要求2所述的載體的宿主細(xì)胞Mach1。

4.一種利用煙草葉綠體作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)如權(quán)利要求1所述的人源堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、構(gòu)建如權(quán)利要求2所述的煙草葉綠體表達(dá)載體pWX-Nt03；

步驟2、bFGF基因的葉綠體轉(zhuǎn)化及同質(zhì)化篩選，得到煙草葉綠體轉(zhuǎn)bFGF基因的同質(zhì)化植株；

步驟3、葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草植株中bFGF表達(dá)量分析；

步驟4、純化重組人源堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，得到煙草葉綠體表達(dá)的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用煙草葉綠體作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人源堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于，所述步驟1中構(gòu)建煙草葉綠體表達(dá)載體pWX-Nt03具體為：

1.1)、在保持氨基酸序列不發(fā)生改變的前提下，利用Gene Designer將編碼基因的所有密碼子采用煙草葉綠體密碼子最適編碼方式進(jìn)行密碼子替換，對(duì)經(jīng)修飾后的基因序列再通過(guò)DNAMAN7.0和Vector NTI 10.0軟件分析其中的酶切位點(diǎn)信息，將第35位氨基酸Ile的編碼密碼子由第1最適密碼子TAT，變更為第2最適密碼子TAC以消除EcoR I酶切位點(diǎn)；將第104位氨基酸Tyr的編碼密碼子由第1最適密碼子TCT，變更為第2最適密碼子TCA以消除Psi I酶切位點(diǎn)；將第109位氨基酸Ser的編碼密碼子由第1最適密碼子ATT，變更為第2最適密碼子ATA以消除Xba I和Bgl II酶切位點(diǎn)；優(yōu)化后的人源堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因序列見(jiàn)SEQ ID NO.1所示；

1.2)、構(gòu)建煙草葉綠體表達(dá)載體pWX-Nt03，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人源堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因bFGF，由葉綠體特異性融合啟動(dòng)子PrrnPclpPrbcL驅(qū)動(dòng)，并由煙草葉綠體終止子TpsbA終止，構(gòu)成目的基因表達(dá)框，作為報(bào)告基因的綠色熒光蛋白基因GFP和作為篩選標(biāo)記基因的壯觀霉素抗性基因aadA依次位于煙草葉綠體啟動(dòng)子Prrn與煙草葉綠體終止子Trps16之間，構(gòu)成篩選標(biāo)記表達(dá)框；上述兩個(gè)表達(dá)框化學(xué)合成后，通過(guò)酶切連接導(dǎo)入來(lái)自煙草葉綠體基因組中的部分16S核糖體RNA基因與異亮氨酸轉(zhuǎn)移RNA基因構(gòu)成的16S-trnI片段和丙氨酸轉(zhuǎn)移RNA基因與部分23S核糖體RNA基因構(gòu)成的trnA-23S片段兩段同源片段之間，最終獲得用于生產(chǎn)人源堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的煙草葉綠體表達(dá)載體，命名為pWX-Nt03。