[發明專利]一種利用HRM法進行牛/羊肉鑒別的標記引物和方法

有效

• 申請號: 201510309901.3
• 申請日: 2015-06-08
• 公開（公告）號: CN104962618B
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 李春保;吳洽宇;周光宏
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;楊秀麗

1.一種牛肉鑒別標記，其特征在于：標記為3個，分別為：

牛肉基因標記1，序列如SEQ ID NO.1所示；

牛肉基因標記2，序列如SEQ ID NO.2所示；

牛肉基因標記3，序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一種利用HRM法進行牛肉鑒別的標記引物，其特征在于： 根據牛肉基因標記1，設計標記引物對1；其中，

牛肉標記引物1F：GTTTGACCTGCTCCTAACTCCATCCC，

牛肉標記引物1R：GGAGGCAGTCGTCAGGCTATTCAA；

根據牛肉基因標記2，設計標記引物對2；其中，

牛肉標記引物2F：GCAGTGAGATGACCCCGTGGA，

牛肉標記引物2R：GCCATAAGGGAGGAACACTCTGAC；

根據牛肉基因標記3，設計標記引物對3；其中，

牛肉標記引物3F：ACAGTGGGAACATTTCAAAGGAGGC，

牛肉標記引物3R：GGTGTCAGAGGACCTGTCAGTGGAGT。

3.一種羊肉鑒別標記，其特征在于：標記為3個，分別為：

羊肉基因標記1，序列如SEQ ID NO.4所示；

羊肉基因標記2，序列如SEQ ID NO.5所示；

羊肉基因標記3，序列如SEQ ID NO.6所示。

4.一種利用HRM法進行羊肉鑒別的標記引物，其特征在于：根據羊肉基因標記1，設計標記引物1；其中，

羊肉標記引物1F：GGTGCTGAATGAGAAATG，

羊肉標記引物1R：CTAAATGGGTCAGAAACC；

根據羊肉基因標記2，設計標記引物2；其中，

羊肉標記引物2F：CGATTCAGATGCCAAGAG，

羊肉標記引物2R：TGAGAAGGGATACAAGCA；

根據羊肉基因標記3，設計標記引物3；其中，

羊肉標記引物3F：CTTTGCCACATTCATTAC，

羊肉標記引物3R：TCAGTGTACGCTCAACTC。

5.一種利用HRM法進行牛肉鑒別的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

1）選取特異存在于牛基因中的位點，并根據選取位點，設計相應引物；

2）取牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鵝肉品種，每個品種7個樣品，每份樣品150mg-250mg，分別提取DNA；

3）利用HRM法對每個樣品進行檢測：樣品DNA在實時熒光PCR儀中進行PCR擴增過程，擴增結束后，在此儀器中測試每個樣品的熔解溫度，儀器通過收集到的熒光信號繪制相應的熔解曲線；

4) 分析不同品種檢測得到的溶解曲線圖，可以發現牛肉標記引物1、2、3用于牛肉檢測時可以形成單一的明顯熔解峰，而在用于豬肉、雞肉、鴨肉、鵝肉檢測時，均無單一的熔解峰，因此可以確定通過牛肉標記引物1、2、3可以特異性地檢測出牛肉存在；

5）后期，提取待檢測肉樣品的DNA，用HRM法對DNA樣品進行檢測后，與真牛肉的檢測結果進行比對，驗證所分析的待檢測肉樣品是牛肉；

所述牛基因中的位點為：

牛肉基因標記1，序列如SEQ ID NO.1所示；

牛肉基因標記2，序列如SEQ ID NO.2所示；

牛肉基因標記3，序列如SEQ ID NO.3所示；

所述引物為：

標記引物對1；其中，

牛肉標記引物1F：GTTTGACCTGCTCCTAACTCCATCCC，

牛肉標記引物1R：GGAGGCAGTCGTCAGGCTATTCAA；

標記引物對2；其中，

牛肉標記引物2F：GCAGTGAGATGACCCCGTGGA，

牛肉標記引物2R：GCCATAAGGGAGGAACACTCTGAC；

標記引物對3；其中，

牛肉標記引物3F：ACAGTGGGAACATTTCAAAGGAGGC，

牛肉標記引物3R：GGTGTCAGAGGACCTGTCAGTGGAGT。