[發明專利]一種重組G-CSF（15-75）多肽畢赤酵母菌的發酵方法

有效

• 申請號: 201510309230.0
• 申請日: 2015-06-06
• 公開（公告）號: CN105002103B
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發明（設計）人: 張貴民;馬魯南;張蘇
• 申請（專利權）人: 山東新時代藥業有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P21/02;C12R1/84
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本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種重組人粒細胞刺激因子重組工程菌的發酵培養方法。所述工程菌為G?SCF(15?75)的巴斯德畢赤酵母菌，其發酵過程包括種子培養和發酵培養，通過優化制備方案，發酵過程中通過在發酵液中甘油補料培養、使得G?CSF(15?75)蛋白的表達量較高，每升發酵液中G?CSF蛋白含量均在2g/L以上，生物活性不低于1.0×10⁸IU/mg，電泳表達量在92％以上，顯著優于現有技術。

技術領域

本發明涉及重組畢赤酵母的發酵，尤其涉及制備重組人粒細胞刺激因子多肽G-CSF(15-75)的畢赤酵母菌的發酵方法

背景技術

人粒細胞刺激因子(human granulocyte colony-stimulating factors,hG-CSF)是一種特異的作用于粒系祖細胞，促進其向成熟中性粒細胞增殖、分化并維持其功能、存活所必須的糖蛋白造血生長因子。1986年，由Nagata等從人鱗狀細胞癌細胞系CHU-II中分離了hG-CSF基因，首次確定了其核苷酸序列并在COS細胞中表達(NagataS etal，Nature，1986，319：415-418)。人類有兩種不同的G-CSF的cDNA，分別編碼含207和204個氨基酸的前體蛋白，均有30個氨基酸的信號肽，成熟蛋白分子為177和174個氨基酸，前者除了在成熟分子N端35位處插了3個氨基酸外，其余的序列與174氨基酸分子相同。

人G-CSF分子量19.6kD，PI為6.1，O-糖基化，對酸堿(pH2～10)、熱以及變性劑等相對較穩定。hG-CSF有5個半胱氨酸殘基，其中4個半胱氨酸殘基在Cys36與Cys42，Cys74與Cys64之間形成兩對二硫鍵；Cys17為不配對半胱氨酸，二硫鍵的形成對于維持G-CSF生物學功能非常重要。G-CSF在臨床應用上具有重要意義，骨髓移植時可促進中性白細胞的恢復；改善再生障礙性貧血伴隨的中性白細胞缺乏癥；明顯改善癌癥化療時引起的嚴重的中性粒細胞缺乏，加大腫瘤治療的力度，增強治療效果；廣泛應用于其他伴有中性粒細胞減少的疾病及抗感染等的治療。

G-CSF于1991年被美國FDA批準投放市場，用于治療放療后中性粒細胞減少癥，長效的PEG化的G-CSF也獲得FDA的批準，國內開發的G-CSF二聚體F-627也已完成Ⅱ期臨床，并取得較好的效果。John.F.Reidhaar-Olson研究發現G-CSF的Leu15、Glu19、Gln25、Leu31、Lys34、Lys40、Leu47、Val48、Leu49、Leu54對蛋白活性起重要作用，二硫鍵對于受體的二聚化，激活下游信號傳導起重要作用。目前，國內生產的G-CSF大多數為大腸桿菌表達產物，在生產過程中,大腸桿菌表達蛋白的純化工藝繁瑣，周期長，回收率低的特點限制了其在大規模生產中的應用。畢赤酵母表達外源蛋白技術已經成熟，且分泌表達外源蛋白時更易于純化，關于G-SCF的發酵，國內也有報道。

中國發明專利CN98103011.4公開了粒細胞集落刺激因子的制備的技術方案，該技術方案利用工程菌部分蛋白酶基因被突變、外膜易破裂的特點，通過控制較低的發酵溫度，提高了發酵產量，使分泌速度減慢，降低了蛋白被降解的機率，利用該發明得到的蛋白經純化后獲得的蛋白純度為99％，產品活性及穩定性達到天然G-CSF的水平。

中國發明專利CN1313612C公開了重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，通過該技術方案中公開的發酵方法，誘導結束后雖說表達量達50％，但仍采用42℃熱誘導。

中國發明專利CN10215489A公開了一種rhG-CSF重組工程菌的發酵培養方法，使用大腸桿菌發酵，但是表達量均在60％以下。

針對現有技術中采用了大腸桿菌和酵母菌進行發酵表達產生完成片段的G-CSF，但利用大腸桿菌難以解決復性問題，且要求的技術較高，由于表達的片段是完成的G-CSF，因此表達量可能會有所降低，在進行表達載體的轉化過程中，帶來一定的困難。

發明內容