[發(fā)明專利]一種重組G-CSF（15-75）多肽畢赤酵母菌的發(fā)酵方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510309230.0
• 申請(qǐng)日: 2015-06-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105002103B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張貴民;馬魯南;張?zhí)K
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12P21/02;C12R1/84
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1.一種重組G-CSF15-75畢赤酵母的發(fā)酵方法，其特征在于，包括重組G-CSF15-75多肽畢赤酵母的種子培養(yǎng)和重組G-CSF15-75多肽畢赤酵母的發(fā)酵培養(yǎng)，重組G-CSF15-75多肽畢赤酵母是保藏號(hào)為CGMCC NO:10713的巴斯德畢赤酵母菌；

其中，種子培養(yǎng)過(guò)程為：

（1）挑取畢赤酵母菌單菌落接種至含0.5mg/ml G418的10ml YPD培養(yǎng)基中，26~32℃，250rpm培養(yǎng)10~25小時(shí)，得到一級(jí)種子液；

（2）將一級(jí)種子液按照2%的體積接種到200ml BMGY培養(yǎng)基中，26-32℃，250rpm培養(yǎng)10-25小時(shí)，得到二級(jí)種子液；

發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程為：

（1）甘油培養(yǎng)：

①、30L發(fā)酵罐中加入10L含有4%甘油的BMS培養(yǎng)基，121℃，30min滅菌；所述BMS培養(yǎng)基的配方為：85%磷酸25ml/L、硫酸鈉0.4g/L、硫酸鈣0.48g/L、硫酸鉀20.13g/L、氫氧化鈉4g/L、硫酸鎂14.9g/L、甘油45g/L；

②、待培養(yǎng)基冷卻至30℃，調(diào)整攪拌速度400rpm，通氣量0.6m/h，用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至4.5~6.0；

③、培養(yǎng)基中添加41.5~43.5mL PTM1微量元素溶液，按照初始體積6-12%的接種量接種，開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵液中的溶氧量50~80%時(shí)培養(yǎng)18~24小時(shí)，溶氧量值為95%~100%時(shí)細(xì)胞的濕重為160~180g/L；

（2）甘油補(bǔ)料培養(yǎng)：

每升甘油中含有12ml的PTM1微量元素溶液，進(jìn)行甘油補(bǔ)料時(shí)，按重量比計(jì)算，甘油的濃度為1~3%，補(bǔ)料培養(yǎng)后細(xì)胞濕重為240~280g/L；

（3）甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)：

調(diào)整發(fā)酵罐溫度至26~32℃，開(kāi)始流加甲醇，其中每升甲醇中含有12ml的PTM1微量元素溶液，誘導(dǎo)55~65小時(shí)，細(xì)胞濕重為350~563g/L。

2.如權(quán)利要求1所述的重組G-CSF15-75畢赤酵母的發(fā)酵方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)過(guò)程步驟（1）的培養(yǎng)條件為30℃，250rpm培養(yǎng)18小時(shí)；所述的種子培養(yǎng)過(guò)程步驟（2）的培養(yǎng)條件為30℃，250rpm培養(yǎng)18小時(shí)。

3.如權(quán)利要求1所述的重組G-CSF15-75畢赤酵母的發(fā)酵方法，其特征在于，重組G-CSF15-75多肽畢赤酵母的發(fā)酵培養(yǎng)為：

（1）甘油培養(yǎng)：

①、30L發(fā)酵罐中加入10L含有4%甘油的BMS培養(yǎng)基，121℃，30min滅菌；

②、待培養(yǎng)基冷卻至30℃，調(diào)整攪拌速度400rpm，通氣量0.6m/h，用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至5.0；

③、培養(yǎng)基中添加41.5~43.5mL PTM1微量元素溶液，按照初始體積8%的接種量接種，開(kāi)始發(fā)酵；發(fā)酵液中的溶氧量50~80%時(shí)培養(yǎng)18~24小時(shí)，溶氧量值為100%時(shí)細(xì)胞濕重為180g/L；

（2）甘油補(bǔ)料培養(yǎng)：

甘油培養(yǎng)之后進(jìn)行甘油補(bǔ)料培養(yǎng)，每升甘油中含有12ml的PTM1微量元素溶液，進(jìn)行甘油補(bǔ)料時(shí)，按重量比計(jì)算，甘油的濃度為1%，補(bǔ)料培養(yǎng)后細(xì)胞濕重為280g/L；

（3）甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)：

調(diào)整發(fā)酵罐溫度至26℃，開(kāi)始流加甲醇，其中每升甲醇中含有12ml的PTM1微量元素溶液，誘導(dǎo)60小時(shí)，細(xì)胞濕重為478g/L。

4.如權(quán)利要求1所述的重組G-CSF15-75畢赤酵母的發(fā)酵方法，其特征在于，所述甘油培養(yǎng)中步驟②調(diào)節(jié)pH的調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉、氨水、二乙胺、三乙胺溶液中的一種或者兩種。

5.如權(quán)利要求1所述的重組G-CSF15-75畢赤酵母的發(fā)酵方法，其特征在于，所述甘油補(bǔ)料培養(yǎng)中補(bǔ)料時(shí)的轉(zhuǎn)速為450rpm，補(bǔ)料速度為0~2小時(shí)流速為24.35ml/（L/h），2~4小時(shí)為18.55ml/（L/h），4~5小時(shí)為14.25ml/（L/h），完畢之后將轉(zhuǎn)速調(diào)整為520rpm。