[發(fā)明專利]一種用于黃曲霉毒素B1富集分離的適配體-磁性納米粒子制備及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510305417.3
• 申請日: 2015-06-05
• 公開（公告）號: CN104959114A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發(fā)明（設計）人: 廖且根;羅林廣
• 申請（專利權）人: 江西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量安全與標準研究所
• 主分類號: B01J20/22
• 分類號: B01J20/22;B01J20/28;B01J20/30;G01N1/34
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產(chǎn)權代理有限公司 11250
• 代理人: 趙敏

技術領域

本發(fā)明涉及黃曲霉毒素B1樣本的凈化處理工藝，具體涉及一種黃曲霉毒素B1分離的適配體-磁性納米粒子制備及應用方法。

背景技術

黃曲霉毒素B1均為黃曲霉菌、寄生曲霉菌產(chǎn)生的代謝物，具有致癌、致畸、致突變的作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的一種真菌毒素，一般食品加工條件都不易破壞，因此給消費者的飲食安全埋下了巨大的隱患。各國對食品中黃曲霉毒素殘留量現(xiàn)狀非常重視，制定了相應的限量標準，如我國規(guī)定大米、食用油中黃曲霉毒素允許量標準為(B1+B2+G1+G2)10ng/g。

目前，黃曲霉毒素B1的前處理技術有免疫親和柱、多功能凈化柱等，這些凈化柱價格較貴，多為一次性的，使得分析成本較高、耗時長、選擇性低，嚴重制約了分析方法的發(fā)展。

有關對磁納米粒子進行修飾，并應用于磁性納米分離試劑的研究已有報道。磁性納米粒子具有較大比表面積，易于利用氨基、環(huán)氧基等官能團進行化學修飾，經(jīng)修飾后的磁性納米粒子能夠與被測試樣品相結合，再利用外加磁場，使磁性納米粒子可以快速從復雜的樣液中分離。

申請?zhí)枮镃N102680673的專利申請公開了一種將黃曲霉毒素B1抗體與磁性微粒偶聯(lián)，制備出具有特異性的免疫磁性微粒，用于樣本中黃曲霉毒素B1凈化。該發(fā)明改善了分離效率，但同樣存在抗體的不足，不易保存，再生后效率低等缺陷。核酸適配體作為一種人工篩選的特異性DNA或RNA片段。與抗體相比，核酸適配體具有易合成、易修飾、易固定、可反復使用和長期保存的優(yōu)點，并且核酸適配體作為識別分子在蛋白質研究、藥物檢測、醫(yī)學診斷和食品安全等方面得到了廣泛應用。

然而，單獨的磁性納米粒子并不具有對目標物的特異性識別。因此，對于復雜樣品中微量的黃曲霉毒素B1的高選擇、快速、有效的分離是亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術問題，本發(fā)明的目的提供一種用于黃曲霉毒素B1分離的適配體-磁性納米粒子復合物，進一步地，本發(fā)明還提供一種用于黃曲霉毒素B1分離的適配體-磁性納米粒子復合物的制備，更進一步地，本發(fā)明還涉及一種用于黃曲霉毒素B1分離的適配體-磁性納米復合物的應用，以解決背景技術中黃曲霉毒素B1樣品凈化分離操作復雜、分離效率低等問題。

本發(fā)明首先提供一種用于黃曲霉毒素B1分離的適配體-磁性納米粒子復合物，包括如下結構：

(1)由順磁性的Fe₃O₄磁納米粒子構成內(nèi)核層；

(2)包覆內(nèi)核層的硅烷化層，所述的硅烷化試劑為3-(2,3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷；

(3)外殼層表面為黃曲霉毒素B1適配體的修飾層，黃曲霉毒素B1適配體的序列為：5’-NH₂-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’。

進一步地，本發(fā)明還涉及一種用于黃曲霉毒素B1的適配體-磁性納米粒子復合物的制備方法，它包括了以下步驟：

(1)通過共沉淀技術、制備出Fe₃O₄磁納米粒子，在外加磁場下，洗滌納米粒子，冷凍干燥；

(2)使用3-(2,3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷在甲苯體系中對步驟(1)的磁納米粒子表面進行修飾，得到修飾了環(huán)氧官能團的磁納米粒子，用乙醇和甲苯反復洗滌除去未反應的3-(2,3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷；

(3)使用PBS緩沖溶液超聲分散所述步驟(2)得到的磁納米粒子，加入黃曲霉毒素B1適配體，37℃孵育12小時，反應完成后，磁分離棄去上清液，所得磁性納米粒子溶于1mol/L?pH為8.0的乙醇胺中，封閉未反應的環(huán)氧官能團，40-50℃孵育4小時，反應完成后，磁分離棄去上清液，并用PBS緩沖溶液反復清洗，最終獲得黃曲霉毒素B1適配體-磁性納米粒子復合物。

本發(fā)明第三方面提供了.黃曲霉毒素B1適配體-磁性納米粒子復合物的應用方法，包括步驟：

(1)按照上述的制備方法值得適配體-磁性納米粒子復合物；

(2)樣本用甲醇-水或乙腈-水進行提取，0.01～0.1mol/LpH7.4的PBS緩沖液稀釋至有機溶劑比例少于10％(體積分數(shù))；

(3)將上述步驟(2)稀釋液與步驟(1)復合物進行反應，捕獲黃曲霉毒素B1。磁性分離，棄上清。

(4)甲酸甲醇(1+99，v/v)或甲酸乙腈(1+99，v/v)作為洗脫液加入到步驟(3)得到的磁性納米粒子，室溫振蕩，磁性分離，上清液為凈化后黃曲霉毒素B1樣本。