[發明專利]一種同時檢測水中狗、豬、雞糞便污染的PCR試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201510305364.5
• 申請日: 2015-06-05
• 公開（公告）號: CN104846113B
• 公開（公告）日: 2017-11-10
• 發明（設計）人: 張徐祥;何席偉;陳慧梅;于紅霞;史薇
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 蔣海軍

技術領域

本發明涉及水體污染檢測領域，更具體地說，涉及一種同時檢測水中狗、豬、雞糞便污染的PCR試劑盒及其檢測方法。

背景技術

近年來，隨著人口和經濟的增長，水體污染情況日趨嚴重，其中糞便污染尤為突出。糞便污染物進入水體后不僅會增加水體氮磷含量，造成水體富營養化，并且會帶入糞便中可能存在的致病菌，引發疾病的水體傳播(Baldursson S and Karanis P.Waterborne transmission of protozoan parasites:Review of worldwide outbreaks‐An update 2004‐2010.Water Research 2011；45(20):6603‐6614.)。因此進行水體糞便污染防治已刻不容緩。

糞便污染的潛在污染源種類繁多，畜禽養殖業中的豬、雞等常見物種的糞便排泄物，由于缺乏適當的處理，常常被直接排放到環境中，造成水體糞便污染，另外，隨著寵物(尤其是寵物狗)的數量越來越多，其產生的糞便排泄物也成為了水體糞便污染的來源之一。在點源、面源污染同時存在的情況下，缺乏對糞便污染來源的準確掌握和定位，使得治理工作職能停留在“見污治污”階段，在一定程度上增加了污染治理的成本。如何尋找和區分并快速、準確定位水體中的糞便污染源，成為了解決問題的關鍵。

傳統糞便污染檢測方法通過檢測水中糞便污染指示菌(如大腸桿菌、腸球菌等)來判斷水體糞便污染情況，耗時長且無法區分污染源。通過檢測水體宿主特異性微生物或化學標志物，可以達到糞便污染溯源的目的，但現存的一些微生物及化學標志物特異性不高，往往導致假陽性結果的產生。糞便中存在大量來自脫落腸道細胞的線粒體DNA，由于不同物種的線粒體DNA不同，其中特定片段中存在大量單核苷酸多態位點，使得線粒體DNA具有種屬特異性，可以通過檢測受糞便污染水體中的線粒體DNA片段來達到糞便污染溯源的目的(Caldwell J,Payment P and Villemur R(2011)Mitochondrial DNA as Source Tracking Markers of Fecal Contamination.)。

以PCR為基礎的分子生物學技術的快速發展為水體糞便污染的檢測提供了強有力的工具。但目前常用的基于PCR手段的糞便污染溯源方法通常只能對污染源進行單獨檢測(Caldwell JM and Levine JF.Domestic wastewater influent profiling using mitochondrial real‐time PCR for source tracking animal contamination.Journal of microbiological methods 2009；77(1):17‐22.Schill WB and Mathes MV.Real‐time PCR detection and quantification of mine potential sources of fecal contamination by analysis of mitochondrial cytochrome b targets.Environmental science&technology 2008；42(14):5229‐5234.)。目前尚未公開能夠區分多種污染源的檢測方法。本發明通過比對不同物種的線粒體DNA序列，找到了狗、豬、雞特異性DNA片段，并針對不同片段設計了特異性引物，且不同引物的擴增片段長度具有一定差距，使得在一個PCR反應體系中區豬、狗、雞三種糞便污染源成為可能。

發明內容

1、要解決的問題

目前檢測水體糞便污染的PCR方法通常是對潛在污染源進行逐個排查，耗時久且成本高。針對此問題，本發明提供了一種能夠同時檢測水體中狗、豬、雞糞便污染的PCR試劑盒及其檢測方法，可以達到快速、準確排查或檢測水體糞便污染源的目的。

2、技術方案

本發明的目的通過以下技術方案實現

一種同時檢測水中狗、豬、雞糞便污染的PCR方法及試劑盒，包括引物、Taq酶、dNTP、PCR buffer、Mg²⁺溶液和ddH₂0，其中引物包括：

引物1：5’‐CTGTGCTATGTCAGTATCTCCAG‐3’；

引物2：5’‐GGCTGATTAGTCATTAGTCCATCG‐3’；