[發(fā)明專利]一種同時檢測水中狗、豬、雞糞便污染的PCR試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510305364.5
• 申請日: 2015-06-05
• 公開（公告）號: CN104846113B
• 公開（公告）日: 2017-11-10
• 發(fā)明（設計）人: 張徐祥;何席偉;陳慧梅;于紅霞;史薇
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 蔣海軍

1.一種采用PCR試劑盒同時檢測水體中狗、豬、雞糞便污染的方法，其特征在于，所述的PCR試劑盒包括引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg²⁺溶液和ddH₂O，所述的引物為混合引物，包括：

引物1：5’-CTGTGCTATGTCAGTATCTCCAG-3’；

引物2：5’-GGCTGATTAGTCATTAGTCCATCG-3’；

引物3：5’-CTACTCATACCCAGCAAGCC-3’；

引物4：5’-TAGGAATTAATAGGGCGGGTG-3’；

引物5：5’-CACATGTTATCTGCACCAGC-3’；

引物6：5’-GTTAAGGGTACGAGTTTGTCG-3’；

檢測的具體步驟如下：提取待測水樣DNA，以待測水樣DNA為模板，利用試劑盒中提供的引物1-6、dNTP、PCR buffer、Mg²⁺溶液和ddH₂O進行PCR擴增，PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察條帶存在情況，以此判斷水體糞便污染情況。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種采用PCR試劑盒同時檢測水體中狗、豬、雞糞便污染的方法，其特征在于，所述PCR buffer為10×PCR buffer，所述dNTP濃度為各2.5mmol/L，所述Taq酶濃度為5U/uL，所述Mg²⁺溶液濃度為25mmol/L。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種采用PCR試劑盒同時檢測水體中狗、豬、雞糞便污染的方法，其特征在于，所述PCR擴增反應提體系為5ul的10×PCR buffer；5ul dNTP；0.25ul Taq酶；4ul Mg²⁺；3ul的混合引物1-6，其中每個引物的濃度均為10umol/L；4ul模板DNA；滅菌ddH₂O補足至50ul；反應條件為95℃，預變性5min；95℃30s，59℃30s，72℃45s，40個循環(huán)；72℃7min，4℃保存。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種采用PCR試劑盒同時檢測水體中狗、豬、雞糞便污染的方法，其特征在于，所述凝膠電泳為1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為：電壓120V，電流440mA，時間25min。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種采用PCR試劑盒同時檢測水體中狗、豬、雞糞便污染的方法，其特征在于，判斷水體糞便污染情況的方法是：若凝膠電泳后出現(xiàn)390bp、490bp、和783bp的條帶，則分別對應指示水中存在狗、豬、雞糞便污染。