[發明專利]毛竹種胚誘導愈傷組織形成的方法

有效

• 申請號: 201510297831.4
• 申請日: 2015-06-02
• 公開（公告）號: CN104920213B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發明（設計）人: 項艷;趙康;李媛;陳丹梅;王依依
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 合肥市上嘉專利代理事務所(普通合伙)34125
• 代理人: 王偉

技術領域

本發明涉及林木生物技術和組織培養領域，具體地說涉及一種毛竹種胚誘導愈傷組織形成的方法。

背景技術

毛竹(Phyllostachys?Pubescens)，別名楠竹、孟宗竹、江南竹，屬于禾本科(Gramineae)、竹亞科(Bambusoideae)、剛竹屬(Phyllostachys)植物，多年生常綠散生竹類植物，是中國的傳統經營竹種，集材用、食用、觀賞等眾多用途于一體，并具固土防風作用，廣泛應用于建材、建筑、綠色食品、醫療保健、家具農具、日用品、旅游工藝品、文體文藝器材及環境綠化美化等各個領域。

全國有毛竹林約300萬hm²，約占全國竹林總面積的65％。毛竹林是我國發展高效林業、使農民迅速致富和增強地區財政發展的的重點扶持工程。傳統的毛竹培育技術已經嚴重制約了毛竹產業的發展，培育優良品質、經濟和生態效益更高的毛竹新品種，對實現竹材資源培育的可持續發展具有重大意義。現代生物技術為竹類的育種工作開辟了一條新的途徑，例如可以通過植物組織培養技術來進行高效無性繁殖，甚至還可以在竹子組織培養的基礎上開展基因工程育種的研究。

目前，近90％的竹子組織培養成功的報道是叢生竹種，以毛竹為代表的散生竹種一直是組織培養的難點。關于毛竹組織培養的研究，從已有的報道來看，用新發毛竹筍作為外植體，褐化現象較嚴重。而且多受季節和植物發育時期的限制，取材困難。成熟種子相對來說具有易保存、操作簡單、不受季節和植物發育時期等因素限制的優點，研究較為方便，但是成熟種子愈傷組織誘導率低(低于50％)、污染率較高(高于30％)，成為毛竹培育技術的瓶頸。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種誘導率高、污染率低的毛竹種胚誘導愈傷組織形成的方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：毛竹種胚誘導愈傷組織形成的方法，包括以下步驟：

(1)種子的篩選

取毛竹種子，剝去外稃，采用TTC染色法對毛竹種子進行生活力測定，篩選出生活力高于75％的毛竹種子；

(2)種胚的消毒

取出篩選出的毛竹種子的種胚，切除50％以上的胚乳，用流水沖洗2—4小時，然后置于70—75％(v/v)乙醇中浸泡2—4分鐘，再用無菌水沖洗至表面光滑、背部溝槽中無明顯異物，然后于無菌條件下，置于1—2％(v/v)次氯酸鈉溶液中浸泡振蕩15—20分鐘，再用無菌水沖洗至表面光滑、背部溝槽中無明顯異物，最后于無菌條件下，置于每升加有3—5滴吐溫-80的0.05—0.1％(w/v)升汞中浸泡振蕩30—40分鐘，再去除表面水分備用；

(3)愈傷組織的誘導與增殖

將消毒后的種胚接種到誘導培養基上，暗培養7—10天使愈傷組織形成，然后將愈傷組織分離出來，接種到增殖培養基上增殖培養20—30天即可。

進一步的，所述誘導培養基是以N6/B5/MS復合培養基為基礎，添加3—5mg/L的2，4-D、0.1—0.3mg/L的ZT，500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白，所述N6/B5/MS復合培養基包括1900mg/L的硝酸鉀、1650mg/L的硝酸銨、170mg/L的磷酸二氫鉀、370mg/L的七水合硫酸鎂、440mg/L的二水合氯化鈣、0.75mg/L的碘化鉀、3.0mg/L的硼酸、10.0mg/L的一水合硫酸錳、2.0mg/L的七水合硫酸鋅、0.25mg/L的二水合鉬酸鈉、0.025mg/L的六水合氯化鈷、0.025mg/L的五水合硫酸銅、37.25mg/L的乙二胺四乙酸二鈉、27.85mg/L的七水合硫酸亞鐵、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5mg/L的煙酸、2.0mg/L的甘氨酸、28g/L的蔗糖和8g/L的瓊脂；

所述增殖培養基是以MS培養基為基礎，添加3—5mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白。

本發明的有益效果為：

1.本發明選取毛竹種子的種胚作為外植體，可以直接將毛竹種子的外種皮與內在種胚之間的縫隙處藏納的污垢、泥土和細菌等污染物，以及因嚙齒類動物的咀嚼而殘留的細菌等去除，從而有效降低污染率。

2.本發明切除了種胚的50％以上的胚乳(從種胚形態學上端開始切除)，可以進一步去除污染源(胚乳中含有大量污染菌)，降低污染率，而且雖然切除了大部分胚乳，但是本發明提供的誘導培養基完全能夠提供種胚生長發育所必須的養分，不會影響種胚愈傷組織的形成。