[發明專利]一種基于CRISPR-Cas9基因敲除技術的miR-205基因敲除試劑盒

有效

• 申請號: 201510296784.1
• 申請日: 2015-06-02
• 公開（公告）號: CN105112445B
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 江福能;鄒翠云;鐘惟德;劉文華
• 申請（專利權）人: 廣州輝園苑醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 劉孟斌;劉宇峰

本發明公開了一種基于CRISPR?Cas9基因敲除技術的miR?205基因敲除試劑盒。本發明通過靶標設計軟件優選一定數量的miR?205的CRISPR?Cas9靶標序列，并體外合成sgRNA單鏈，經過處理得到插入片段，隨后將sgRNA利用T4連接酶接入到質粒載體中，通過轉染LNCap細胞株，持續藥篩、熒光檢測，得到miR?205基因敲除細胞株。通過提取細胞DNA，PCR擴增miR?205并純化，將PCR產物變性，再退火的方式形成異源雜交雙鏈，利用T7E1酶切試驗確定CRISPR?Cas9系統對miR?205的剪切效率，獲得驗證優化的miR?205基因敲除CRISPR?Cas9靶序列，并以此構建應用試劑盒，可用于miR?205基因的定向敲除。該試劑盒具有基因敲除效率高、速度快、簡單經濟的特點，在細胞、動物模型構建及醫學臨床研究應用方面前景廣闊。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種miR-205基因敲除試劑盒，特別是一種基于CRISPR-Cas9基因敲除技術的miR-205基因敲除試劑盒。

背景技術

1987年，日本大阪大學(Osaka University)在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)基因進行研究時，發現在這個基因編碼區域的附近存在串聯間隔重復的DNA序列。2002年正式被科學家被稱作“規律間隔成簇短回文重復序列”(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)。

CRISPR是一個特殊的DNA重復序列家族，廣泛分布于細菌和古細菌基因組中。CRISPR位點通常由短的高度保守的重復序列(repeats)組成，重復序列的長度通常21～48bp，重復序列之間被26～72bp間隔序列(spacer)隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列與靶基因進行識別。Cas(CRISPR associated)存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在導向RNA(guide RNA，gRNA)的引導下對靶位點進行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發揮作用。

CRISPR-Cas是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統，這些序列在被轉錄成為RNA后，能夠和細菌產生的一類稱為Cas的蛋白質形成復合體，來對Cas蛋白起到導向作用，因此這段RNA也被稱為導向RNA。當復合體檢測到入侵的DNA和gRNA序列一致時，Cas蛋白就能夠切割入侵的DNA，達到防御的目的。2013年以后，研究者們在包括《science》和《naturebiotechnology》等著名雜志上發表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現精確的基因修飾。

CRISPR-CAS9是一種最新基因組定向基因編輯技術，是來源于細菌獲得性免疫的由RNA指導Cas9蛋白對靶向基因進行修飾的技術。在改造后的CRISPR-CAS9系統中，sgRNA通過與靶位點結合引導CAS9蛋白識別PAM序列，同靶基因結合在PAM區上游對基因組DNA進行切割，從而造成雙鏈斷裂，引發非同源末端連接修復。在修復過程中個別堿基的缺失或插入會造成移碼突變，從而達到基因組定點編輯的目的。

miRNA是一組保守的非編碼小RNA(non-coding small RNA)，長約22nt的非編碼的單鏈RNA分子，廣泛分布在病毒、植物到高等哺乳動物中，大約相當于每種生物體蛋白編碼基因的1％。目前，miRNA已知的功能是在轉錄后水平調控基因的表達，主要作為基因表達的負調控因子，即通過抑制靶基因的翻譯而起調控作用。