[發明專利]一種重組人骨形態發生蛋白-2的循環層析復性方法

有效

• 申請號: 201510296401.0
• 申請日: 2015-06-02
• 公開（公告）號: CN104961820B
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發明（設計）人: 彭繼學;張東剛;屈長宏;劉啟省;楊建軍
• 申請（專利權）人: 煙臺正海生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/51
• 分類號: C07K14/51;C07K1/22;C07K1/113;C07K1/18
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發明公開了一種重組人骨形態發生蛋白?2的循環層析復性方法。本發明提供了一種重組人骨形態發生蛋白?2的復性方法，包括如下步驟：1)變性重組人骨形態發生蛋白?2包涵體，得到變性后蛋白；2)將所述變性后蛋白進行親和層析復性，收集洗脫液，得到復性后重組人骨形態發生蛋白?2二聚體；所述重組人骨形態發生蛋白?2氨基酸序列為序列表中序列2。本發明的實驗證明，本發明的方法復性rhBMP?2蛋白，蛋白濃度高，試劑消耗少，復性率達70％以上，本發明方法適于工業規模化生產；同時也為同類重組蛋白藥物的研發生產提供參考。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體屬于基因重組蛋白藥物領域，涉及一種重組人骨形態發生蛋白-2的循環層析復性方法。

背景技術

骨形態發生蛋白(BMP)是由骨基質分泌的一種疏水性蛋白，屬于轉化生長因子(TGF-β)超家族成員，由Urist等人于1965年首次提出，1972年定義，并于1982年首次從脫鈣骨基質提取物中分離得到的一種活性蛋白質。BMP家族包括BMP-1、2、4、6、7、9、12、14等，其中BMP-2具有明顯誘導未分化成纖維細胞定向分化為成骨細胞的作用，并能調節成骨細胞和成軟骨細胞的分化，誘導異位骨形成和促進骨折愈合的功能。BMP-2是骨生成的啟動因子，可以加速骨的重建，是骨修復基因治療的理想目的基因，是目前唯一能誘導異位成骨的細胞因子，因而成為骨組織工程學研究中最重要的生長因子。目前，BMP-2已成功地用于治療骨不連和骨缺損的修復。BMP一般無種屬特異性，具有跨種屬誘導成骨能力，因而其臨床應用前景十分廣闊。

BMP-2可以通過天然牛骨提取純化和基因重組誘導表達后分離純化兩種方法制備。其中天然提取法成本高，產率低，易失活，不適于工業化生產，逐漸被基因重組法代替。大腸桿菌表達系統憑借技術成熟、表達量高、成本低等優點，成為目前基因重組法生產BMP-2的一個熱點技術。然而，經大腸桿菌表達的BMP-2以無活性的包涵體形式存在于胞內，如何將包涵體通過復性得到具有生物活性的BMP-2二聚體，是重組蛋白藥物研發生產中的關鍵步驟。

常用的BMP-2包涵體復性技術為稀釋復性和透析復性技術，例如國內研究者姚少華等于2005年研究了重組BMP-2稀釋復性、透析復性工藝，并研究了溶菌酶的羥基磷灰石色譜復性工藝；孫奮勇等于2006年進行了重組BMP-2復性工藝研究，采用稀釋復性工藝；王馥麗等于2008年研究了高濃度復性工藝，采用透析復性工藝進行復性。目前的復性工藝存在著蛋白易沉淀復性率低、工藝路線煩瑣生產周期長、復性液消耗大成本高等問題，并不適于工業規模化生產。

發明內容

本發明的目的是提供一種重組人骨形態發生蛋白-2包涵體的復性方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：

1)變性重組人骨形態發生蛋白-2包涵體，得到變性后蛋白；

2)對所述變性后蛋白進行親和層析復性，依次收集洗脫液，得到回收后層析復性液、重組人骨形態發生蛋白-2單體、重組人骨形態發生蛋白-2二聚體和重組人骨形態發生蛋白-2多聚體；

3)變性所述重組人骨形態發生蛋白-2多聚體，得到重組人骨形態發生蛋白-2多聚體變性后蛋白；

4)對所述重組人骨形態發生蛋白-2多聚體變性后蛋白和所述重組人骨形態發生蛋白-2單體進行再次親和層析復性，收集洗脫液，得到循環層析復性的重組人骨形態發生蛋白-2二聚體；

5)合并步驟2)得到的所述重組人骨形態發生蛋白-2二聚體和步驟4)得到的循環層析復性的重組人骨形態發生蛋白-2二聚體，實現重組人骨形態發生蛋白-2包涵體的復性。

上述方法中，

在步驟1)和步驟2)之間，還包括預純化的步驟：將所述變性后蛋白經陽離子交換層析純化，收集洗脫緩沖液，得到預純化后變性蛋白。

上述方法中，