[發明專利]一種重組人骨形態發生蛋白-2的循環層析復性方法

有效

• 申請號: 201510296401.0
• 申請日: 2015-06-02
• 公開（公告）號: CN104961820B
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發明（設計）人: 彭繼學;張東剛;屈長宏;劉啟省;楊建軍
• 申請（專利權）人: 煙臺正海生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/51
• 分類號: C07K14/51;C07K1/22;C07K1/113;C07K1/18
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

1.一種重組人骨形態發生蛋白-2包涵體的復性方法，包括如下步驟：

1）變性重組人骨形態發生蛋白-2包涵體，得到變性后蛋白；

2）對所述變性后蛋白進行親和層析復性，依次收集洗脫液，得到回收后層析復性液、重組人骨形態發生蛋白-2單體、重組人骨形態發生蛋白-2二聚體和重組人骨形態發生蛋白-2多聚體；

3）變性所述重組人骨形態發生蛋白-2多聚體，得到重組人骨形態發生蛋白-2多聚體變性后蛋白；

4）對所述重組人骨形態發生蛋白-2多聚體變性后蛋白和所述重組人骨形態發生蛋白-2單體進行再次親和層析復性，收集洗脫液，得到循環層析復性的重組人骨形態發生蛋白-2二聚體；

5）合并步驟2）得到的所述重組人骨形態發生蛋白-2二聚體和步驟4）得到的循環層析復性的重組人骨形態發生蛋白-2二聚體，實現重組人骨形態發生蛋白-2包涵體的復性；

在步驟1）和步驟2）之間，還包括預純化的步驟：將所述變性后蛋白經陽離子交換層析純化，收集洗脫緩沖液，得到預純化后變性蛋白；

步驟2）包括如下步驟：

2）-1，將所述變性后蛋白上樣到親和層析柱，得到上樣后親和層析柱，再用層析復性液流經所述上樣后親和層析柱，靜置復性；

所述層析復性液由終濃度為0.1mol/L Tris-HCl、終濃度為0.5mol/L尿素、終濃度為0.1mol/L 2-環己氨基乙磺酸、終濃度為0.2mol/L 精氨酸、終濃度為0.5mmol/L 氧化型谷胱甘肽、終濃度為1mmol/L 還原型谷胱甘肽和水組成；

2）-2，用洗脫緩沖液A對2）-1處理后的層析柱進行洗脫，收集洗脫液，得到回收后層析復性液；所述洗脫緩沖液A為洗脫緩沖液FH-A；

2）-3，用洗脫緩沖液B對2）-2處理后的層析柱進行洗脫，收集洗脫液，得到重組人骨形態發生蛋白-2單體；所述洗脫緩沖液B為由體積分數75%的平衡緩沖液FH-A 和體積分數25%的洗脫緩沖液FH-B-1組成的混合液；

2）-4，用洗脫緩沖液C對2）-3處理后的層析柱進行洗脫，收集洗脫液，得到重組人骨形態發生蛋白-2二聚體；所述洗脫緩沖液C為由體積分數55%平衡緩沖液FH-A和體積分數為45%的洗脫緩沖液FH-B-2組成的混合液；

2）-5，用洗脫緩沖液D對2）-4處理后的層析柱進行洗脫，收集洗脫液，得到重組人骨形態發生蛋白-2多聚體；所述洗脫緩沖液D為洗脫緩沖液FH-B-3；

所述洗脫緩沖液FH-A由終濃度為50mmol/L Tris-HCl、終濃度為3mol/L尿素和水組成；

所述洗脫緩沖液FH-B-3由終濃度為50mmol/L Tris-HCl、終濃度為3mol/L尿素、終濃度為1 mol/L NaCl和水組成；

所述洗脫緩沖液FH-B-2為將所述洗脫緩沖液FH-B-3中的NaCl終濃度調節為0.45mol/L得到的溶液；

所述洗脫緩沖液FH-B-1為將所述洗脫緩沖液FH-B-3中的NaCl終濃度調節為0.25mol/L得到的溶液；

所述2）-2，所述收集洗脫液為收集0.8個柱體積的洗脫液；所述洗脫的時間為25分鐘

所述2）-3，所述收集洗脫液為收集3個柱體積的洗脫液；所述洗脫的時間為70分鐘，

所述2）-4，所述收集洗脫液為收集1.5個柱體積的洗脫液；所述洗脫的時間為38分鐘，

所述2）-5，所述收集洗脫液為收集1.5個柱體積的洗脫液；所述洗脫的時間為25分鐘；

步驟4）包括如下步驟：

4）-1，將所述重組人骨形態發生蛋白-2多聚體變性后蛋白和所述重組人骨形態發生蛋白-2單體上樣親和層析柱，得到上樣后親和層析柱，再將所述回收層析復性液流經所述上樣后層析柱，靜置復性；

4）-2，用所述洗脫緩沖液B洗滌4）-1處理后的層析柱；所述洗滌流速為80±20ml/min；

4）-3，用所述洗脫緩沖液C洗脫4）-2處理后的層析柱，收集洗脫液，得到循環層析復性的重組人骨形態發生蛋白-2二聚體；

4）-3中，所述收集洗脫液為收集0.8個柱體積的洗脫液，所述洗脫的時間為20分鐘；

所述陽離子交換層析的層析介質為SPSepharose；

所述親和層析的層析介質為Heparin Sepharose；

所述重組人骨形態發生蛋白-2的氨基酸序列為序列2。