[發明專利]一種鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法

在審

• 申請號: 201510295301.6
• 申請日: 2015-06-01
• 公開（公告）號: CN104962611A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發明（設計）人: 李孝軍;白頡;周圓;陳璐敏;單長林;吳博
• 申請（專利權）人: 舟山出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種快速準確的鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法。

背景技術

異尖線蟲病(Anisakiasis)是由于人食入寄生在海魚體內的異尖線蟲科某些種的活的第三期幼蟲而引起的疾病，可表現為急腹癥癥狀及過敏性癥狀。該病呈世界性分布，給人類健康構成嚴重威脅，是一種重要的人獸共患寄生蟲病，也是我國禁止入境的二類寄生蟲病。全球的人體感染病例已達3萬多例并呈上升趨勢。我國對此病報道極少，一方面和我國由異尖線蟲引起過敏的情況較少有關，另一方面與我國居民大多不喜生食食物習慣有關，但隨著吃海鮮、生魚片等飲食時尚的興起和漁業、旅游業的發展，異尖線蟲病可能出現在我國生食海魚的人群中。

在日本、荷蘭、英國、法國、德國以及太平洋地區等20多個國家有異尖線蟲幼蟲寄生與人體消化道各部位的報道，其中日本已報道人體病例14000余例。主要是這些國家居民喜吃腌海魚或喜吃生拌海魚片、魚肝、魚子或烏賊作佐酒佳肴，由此獲得感染，使該病成為一種海洋自然疫源性疾病。我國盡管迄今尚未見有病例報告，但在國內市售海魚中，發現鮐魚、小黃魚、帶魚等小型魚體肌肉或器官組織內的異尖線蟲幼蟲感染率高達100％；從東海和黃海獲得的30種魚和兩種軟體動物發現帶幼蟲率為84％，可見我國人群感染異尖線蟲病的潛在危險性很大。

由于異尖線蟲對人類健康的嚴重危害，該蟲一直是我國出入境口岸檢疫的傳染病、寄生蟲病病原。近年來，隨著進出口貿易的快速發展，我國從國外進口越來越多的水產品。為確保這些水產品的安全，必須對異尖線蟲等傳染性病原進行檢疫。目前，口岸動物檢疫部門對異尖線蟲幼蟲的分類鑒定主要依靠形態學觀察。

發明內容

本發明的目的在于現有對異尖線蟲幼蟲的分類鑒定主要依靠形態學觀察，效率低下，錯誤率高的缺陷而提供一種快速準確的鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法，所述方法包括如下步驟：

a)獲得蟲體樣本：剖檢進出境海魚內臟表面和消化道而獲得異尖線蟲幼蟲蟲種，放入75％的酒精保存備用；

b)樣品總DNA的制備：將步驟a)得到的酒精中保存的異尖線蟲幼蟲用蒸餾水洗凈后剪碎，加入500μL消化液，55℃作用12-20h，苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀DNA，測定濃度后置-20℃保存；

c)rDNA-ITS區PCR擴增：以步驟b)得到的DNA為擴增模板，用針對異尖線蟲rDNA保守區的引物：

NC5：5’-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3’(SEQ?ID?NO.1)和

NC2：5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’(SEQ?ID?NO.2)

進行PCR擴增，目的片段為898-956bp；

d)PCR產物酶切分析：根據已在GenBank注冊的異尖科線蟲ITS序列，經DNASTAR軟件分析，將步驟c)得到PCR產物用HinfΙ和HhaΙ限制性內切酶進行RFLP分析，得到結果。

作為優選，步驟b)中的消化液配方如下：5M?NaCl?12.5μL；0.1MTris-HCl(pH＝8.0)50μL；0.1M?EDTA(pH＝8.0)125μL；10％SDS?100μL；20mg/ml蛋白酶K2.5μL，蒸餾水210μL。

作為優選，步驟c)中PCR擴增體系為50μL，其中：2μL模板DNA，10×PCR?buffer5μL，25mmol/L?dNTP?3μL，25mmol/LMgCl₂?3μL，20μmol/L引物各0.75μL，0.5μL?Taq酶，用雙蒸水補足至50μL；擴增條件為：95℃預變性5min，95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸80s共35個循環，最后72℃延伸7min；產物4℃保存，將擴增的產物用1.5％瓊脂糖進行電泳檢驗。

作為優選，步驟d)中，用HhaΙ酶切，反應體系如下：PCR純化產物10μL，HhaΙ(10U/μL)1μL，10×M?buffer?2μL，滅菌雙蒸水補足至20μL；用HinfΙ酶切，反應體系如下：PCR純化產物14μL，HinfΙ(10U/μL)1.5μL，10×H?buffer?2μL，滅菌雙蒸水補足至20μL。