[發明專利]一種鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法

在審

• 申請號: 201510295301.6
• 申請日: 2015-06-01
• 公開（公告）號: CN104962611A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發明（設計）人: 李孝軍;白頡;周圓;陳璐敏;單長林;吳博
• 申請（專利權）人: 舟山出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.一種鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

a)獲得蟲體樣本：剖檢進出境海魚內臟表面和消化道而獲得異尖線蟲幼蟲蟲種，放入75％的酒精保存備用；

b)樣品總DNA的制備：將步驟a)得到的酒精中保存的異尖線蟲幼蟲用蒸餾水洗凈后剪碎，加入500μL消化液，55℃作用12-20h，苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀DNA，測定濃度后置-20℃保存；

c)rDNA-ITS區PCR擴增：以步驟b)得到的DNA為擴增模板，用針對異尖線蟲rDNA保守區的引物：

NC5：5’-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3’(SEQ?ID?NO.1)和

NC2：5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’(SEQ?ID?NO.2)

進行PCR擴增，目的片段為898-956bp；

d)PCR產物酶切分析：根據已在GenBank注冊的異尖科線蟲ITS序列，經DNASTAR軟件分析，將步驟c)得到PCR產物用Hinf?Ι和Hha?Ι限制性內切酶進行RFLP分析，得到結果。

2.根據權利要求1所述的一種鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法，其特征在于，步驟b)中的消化液配方如下：5M?NaCl?12.5μL；0.1MTris-HCl(pH＝8.0)50μL；0.1M?EDTA(pH＝8.0)125μL；10％SDS?100μL；20mg/ml蛋白酶K2.5μL，蒸餾水210μL。

3.根據權利要求1所述的一種鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法，其特征在于，步驟c)中PCR擴增體系為50μL，其中：2μL模板DNA，10×PCR?buffer?5μL，25mmol/L?dNTP?3μL，25mmol/LMgCl₂?3μL，20μmol/L引物各0.75μL，0.5μL?Taq酶，用雙蒸水補足至50μL；擴增條件為：95℃預變性5min，95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸80s共35個循環，最后72℃延伸7min；產物4℃保存，將擴增的產物用1.5％瓊脂糖進行電泳檢驗。

4.根據權利要求1所述的一種鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法，其特征在于，步驟d)中，用Hha?Ι酶切，反應體系如下：PCR純化產物10μL，Hha?Ι(10U/μL)1μL，10×M?buffer?2μL，滅菌雙蒸水補足至20μL；用Hinf?Ι酶切，反應體系如下：PCR純化產物14μL，Hinf?Ι(10U/μL)1.5μL，10×H?buffer?2μL，滅菌雙蒸水補足至20μL。

5.根據權利要求1所述的一種鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法，其特征在于，步驟d)中，用Hha?Ι與Hinf?Ι酶切，反應體系如下：PCR純化產物12μL，Hha?Ι(10U/μL)0.8μL，Hinf?Ι(10U/μL)1μL，10×M?buffer?1.5μL，10×H?buffer?1.5μL，滅菌雙蒸水補足至20μL。

6.根據權利要求4或5所述的一種鑒定進出口海魚中的異尖線蟲幼蟲的方法，其特征在于，酶切溫度37℃，水浴消化6h，酶切產物用1.5％瓊脂糖進行電泳檢驗。