[發(fā)明專利]原代肝細胞的分離制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510284714.4
• 申請日: 2015-05-28
• 公開（公告）號: CN104818242B
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發(fā)明（設計）人: 包驥;步宏;石毓君
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發(fā)明公開了一種原代肝細胞的分離制備方法，它包括如下步驟：a、肝臟的體外灌流：取離體的動物肝臟，先用灌流液Ⅰ灌流，灌流速度為300?1000mL/min，灌流時間為10?12分鐘；再用灌流液Ⅱ灌流，灌流速度為300?1000mL/min，灌流時間為2?3分鐘；最后用灌流液Ⅲ灌流，灌流速度為400?1200mL/min，灌流時間為25?40分鐘；b、分離肝細胞：洗滌步驟a處理后的肝臟，收集肝細胞懸液，過濾、離心，收集沉淀即可。本發(fā)明原代肝細胞的分離制備方法，可以分離得到的肝細胞數(shù)量、活率與純度均較高的肝細胞，應用前景良好。

技術領域

本發(fā)明屬于醫(yī)學生物技術領域，涉及原代肝細胞的分離制備方法。

背景技術

肝臟作為機體重要的代謝器官，在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用。肝細胞行使了肝臟主要的功能，如清除毒素、參與生物合成和生物轉(zhuǎn)化、代謝多種營養(yǎng)物質(zhì)、儲存葡萄糖、分泌具有促進肝細胞生長的活性物質(zhì)等。機體內(nèi)分離得到的原代肝細胞被應用于藥理毒理學、免疫學、細胞生物學等體外研究，隨著生物人工肝在治療肝衰竭領域的應用，也需要大量、高活性的原代肝細胞作為生物材料。因此，如何分離制備得到高產(chǎn)量、高純度、高存活率的原代肝細胞受到研究者的廣泛關注。

自1976年Seglen首次采用兩步原位灌流法成功分離大鼠肝細胞以來，兩步原位灌流法被證明對分離多種動物肝細胞均有效，成為目前原代肝細胞分離制備的經(jīng)典方法。眾多研究者在該法的基礎上，對肝細胞分離方法進行了改良，在一定程度上提高了肝細胞的總量和活率，但還是不能滿足實際應用的需要。

例如：公開號為CN1632107A，發(fā)明名稱為“生物人工肝用豬和人肝細胞的制備方法”的專利，報道了兩種分離肝細胞的方法，一種是四步灌流，一種是兩步灌流，采用四步灌流時，獲得的肝細胞活率和肝細胞總數(shù)較高，分別為90-99％和6.25×10⁷個/克肝組織，但純度較低，僅為90-95％，且灌流步驟太多，成本高；而兩步灌流雖然步驟少，但是肝細胞活率、肝細胞總數(shù)和純度均不理想，分別僅為80-90％、1.25×10⁷個/克肝組織和80-90％。

Zhang ZG etal.,An updated method for the isolation and culture ofprimary calf hepatocytes,Vet J,2012,191:323-326公開了三步灌流分離肝細胞的方法，但是獲得的肝細胞的總數(shù)、活率均較低，分別為1.12×10⁷個/克肝組織、85.7％。

因此，急需對原代肝細胞的制備方法進一步改進，以制備高產(chǎn)量、高純度、高存活率的原代肝細胞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高效分離原代肝細胞的分離制備方法。

本發(fā)明提供了一種原代肝細胞的分離制備方法，它包括如下步驟：

a、肝臟的體外灌流：取離體的動物肝臟，先用灌流液Ⅰ灌流，灌流速度為300-1000mL/min，灌流時間為10-12分鐘；再用灌流液Ⅱ灌流，灌流速度為300-1000mL/min，灌流時間為2-3分鐘；最后用灌流液Ⅲ灌流，灌流速度為300-1200mL/min，灌流時間為25-40分鐘；

其中，所述灌流液I每升含有如下成分：8.1-8.5克氯化鈉，0.5克氯化鉀，2.2-2.6克HEPES，3.5-4.5克NAC,0.9-1.1克EGTA,其余為去離子水；

所述灌流液II每升含有如下成分：8.1-8.5克氯化鈉，0.5克氯化鉀，2.2-2.6克HEPES，其余為去離子水；

所述灌流液III每升含有如下成分：3.8-4克氯化鈉，0.5克氯化鉀，23-25克HEPES，0.07克二水氯化鈣，3.5-4.5克白蛋白，162-260Wünsch單位膠原酶，其余為去離子水；