[發明專利]原代肝細胞的分離制備方法

有效

• 申請號: 201510284714.4
• 申請日: 2015-05-28
• 公開（公告）號: CN104818242B
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 包驥;步宏;石毓君
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種原代肝細胞的分離制備方法，其特征在于：它包括如下步驟：

a、肝臟的體外灌流：取離體的動物肝臟，先用灌流液Ⅰ灌流，灌流速度為300-1000 mL/min，灌流時間為10-12 分鐘；再用灌流液Ⅱ灌流，灌流速度為300-1000 mL/min，灌流時間為2-3分鐘；最后用灌流液Ⅲ灌流，灌流速度為300-1200 mL/min，灌流時間為25-40分鐘；

其中，所述灌流液I每升由如下成分組成：8.1-8.5克氯化鈉，0.5克氯化鉀，2.2-2.6克HEPES，3.5-4.5克 NAC, 0.9-1.1克EGTA,其余為去離子水；

所述灌流液II每升由如下成分組成：8.1-8.5克氯化鈉，0.5克氯化鉀，2.2-2.6克HEPES，其余為去離子水；

所述灌流液III每升由如下成分組成：3.8-4克氯化鈉，0.5克氯化鉀，23-25克HEPES，0.07克二水氯化鈣，3.5-4.5克白蛋白，162-260 Wünsch單位膠原酶，其余為去離子水；

b、分離肝細胞：洗滌步驟a處理后的肝臟，收集肝細胞懸液，過濾、離心，收集沉淀即可；

其中所述原代肝細胞為豬肝臟的原代肝細胞。

2.根據權利要求1所述的分離制備方法，其特征在于：步驟a中，

所述灌流液I每升由如下成分組成：8.3克氯化鈉，0.5克氯化鉀，2.4克HEPES，3.5-4.5克 NAC, 0.9-1.1克 EGTA,其余為去離子水；

灌流液II每升由如下成分組成：8.3克氯化鈉，0.5克氯化鉀，2.4克HEPES，其余為去離子水；

灌流液III每升由如下成分組成：3.9克氯化鈉，0.5克氯化鉀，24克HEPES，0.07克二水氯化鈣，4克白蛋白，162-260 Wünsch單位膠原酶，其余為去離子水。

3.根據權利要求2所述的分離制備方法，其特征在于：

所述灌流液I每升由如下成分組成：8.3克氯化鈉，0.5克氯化鉀，2.4克HEPES，4克 NAC,0.95克 EGTA,其余為去離子水；

灌流液II每升由如下成分組成：8.3克氯化鈉，0.5克氯化鉀，2.4克HEPES，其余為去離子水；

灌流液III每升由如下成分組成：3.9克氯化鈉，0.5克氯化鉀，24克HEPES，0.07克二水氯化鈣，4克白蛋白，216 Wünsch單位膠原酶，其余為去離子水。

4.根據權利要求3所述的分離制備方法，其特征在于：所述灌流液III中，膠原酶為膠原酶SERVA NB8或者膠原酶 Roche Liberase^TM。

5.根據權利要求1-4任意一項所述的分離制備方法，其特征在于：

所述灌流液I的灌流速度為400 mL/min，灌流時間為10 分鐘；

灌流液II的灌流速度為400 mL/min，灌流時間為2分鐘；

灌流液III的灌流速度為500 mL/min，灌流時間為30分鐘。

6.根據權利要求1-4任意一項所述的分離制備方法，其特征在于：步驟a中，灌流液I、灌流液II、灌流液III的灌流溫度均為37℃。

7.根據權利要求1-4任意一項所述的分離制備方法，其特征在于：步驟a中，灌流液III的灌流方式為循環灌流。

8.根據權利要求1-4任意一項所述的分離制備方法，其特征在于：步驟a中，灌流液I、灌流液II和/或灌流液III的溶解氧分壓為180-260mmHg。

9.根據權利要求1-4任意一項所述的分離制備方法，其特征在于：步驟b中， 所述過濾是用四層脫脂紗布過濾。

10.根據權利要求1-4任意一項所述的分離制備方法，其特征在于：步驟b中，所述離心是多次離心，具體步驟是：

（1）離心，棄去上清液；

（2）重懸沉淀，離心；

（3）將過程（2）重復一次。