[發明專利]一種利用DNA條形碼鑒別茶樹品種的方法

在審

• 申請號: 201510283025.1
• 申請日: 2015-05-28
• 公開（公告）號: CN104946745A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 劉振;楊陽;趙洋;楊培迪;成楊;寧靜
• 申請（專利權）人: 湖南省茶葉研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 李勤輝

技術領域

本發明涉及茶樹品種的鑒別方法。

背景技術

我國目前已選育了114個國家級良種和154個省級良種，如何對這些品種進行準確鑒定對育種者權益保護和新品種推廣等具有重要意義。茶樹新品種DUS(特異性、一致性、穩定性的簡稱)測試指南是中國為國際植物新品種保護聯盟(UPOV)制訂的第一個植物新品種DUS測試指南，它的制定為我國茶樹資源評價和保護提供了技術基礎和授權依據。隨著分子標記技術不斷發展，UPOV已將DNA標記鑒定納入農作物品種DUS測試內容。DNA分子標記技術不僅具有穩定性、品種間變異的可識別性、最小品種內變異及實驗結果的可靠性，而且具有簡便、迅速等優點，非常適合品種鑒定，克服了傳統形態標記鑒定周期長、誤差大、性狀差異小的缺點。國際植物品種權保護聯盟(UPOV)在BMT測試指南草案中已將構建DNA指紋數據庫的標記方法確定為SSR和SNP。而SSR標記因引物開發廉價、操作簡單、易于推廣，已被UPOV生物化學和分子技術工作組驗證為植物新品種保護最廣泛應用的標記體系。UPOV雖已將作物SSR標記鑒定納入農作物品種DUS測試內容，但對不同作物的測試流程及具體方法卻沒有明確的規定。

發明內容

針對目前依靠茶樹植物學性狀對茶樹品種進行鑒定周期長、誤差大、鑒定性狀差異小品種困難大、對鑒定者經驗要求豐富等問題，本發明提供了一種簡單、快速、準確利用DNA條形碼鑒別茶樹品種的方法。

本發明解決上述技術問題采用的技術方案是：一種利用DNA條形碼鑒別茶樹品種的方法，包括以下步驟：

(1)DNA提取：分別提取數個茶樹品種的DNA；

(2)引物篩選：篩選條帶清晰、穩定且重復性好的數對SSR引物；

(3)PCR擴增：將上述提取的DNA中的每個DNA分別與每對篩選的SSR引物混合配成PCR反應試劑進行擴增；

(4)SSR標記的PCR產物分析：將每一PCR反應產物進行凝膠電泳后染色，然后采用凝膠成像儀拍照記錄；

(5)分子條形碼的構建：將上述記錄的每對SSR引物上的每一個品種的電泳圖上清晰的條帶記為“1”，同一位置無帶或不易分辨的弱帶計為“0”，建立原始數據庫；然后把每對SSR引物上每一個品種位點的1、0數據轉換為字母；再將數對SSR引物上對應品種轉換的字母進行組合，形成每一個品種的DNA條形碼；

(6)鑒別：以上述DNA條形碼為標準鑒別茶樹品種的真偽。

作為優選，采用試劑盒法提取DNA。

作為優選，篩選出

F:CTCCGATTACTTTCTTCC

R:GCAGGTTAGCGGTGGTTA；

F:TAGGGTTTTAGTTTCAG

R:AACATCCTTGCCTCGTC；

F:GTGAAGTTAGTTGTTACTCTTTTTTGG

R:AGGGGAAGTGAGGAGGCAT；

F:ATGCTTCAGGGAGTGACCAT

R:ATTTATGCCAAACTACCAACAG

四對SSR引物。

作為優選，每一PCR反應試劑按體積份數6.65份ddH₂O、1.0份10ng/μL的上述提取的一個品種的DNA、1.0份10×Buffer、0.7份25mM的Mg²⁺、0.2份10mM的dNTP、各0.1份10μM的primers和0.25份2U/μL的Taq?polymerase混合配成而成。

作為優選，PCR擴增條件為94℃變性3min，然后94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸50s，共30個循環，完成以上循環以后，72℃延伸10min，最后將PCR產物冷卻到室溫或者4℃。

作為優選，上述PCR擴增重復一次，比較兩次擴增結果，如果兩次結果不一致，PCR擴增再重復一次，以有兩次擴增一致的結果為準。

作為優選，將PCR產物與6×loading?buffer混合，采用10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后進行硝酸銀染色，直到有清晰條帶出現為止。

作為優選，硝酸銀染色的步驟為：①用10％乙醇和0.5％乙酸固定5～8min；②用10％乙醇和0.5％乙酸再次固定5～8min；③用0.2％AgNO₃染色10～15min；④用蒸餾水沖洗數秒；⑤用1.5％NaOH和0.5％甲醛顯色。