[發明專利]一種利用DNA條形碼鑒別茶樹品種的方法

在審

• 申請號: 201510283025.1
• 申請日: 2015-05-28
• 公開（公告）號: CN104946745A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 劉振;楊陽;趙洋;楊培迪;成楊;寧靜
• 申請（專利權）人: 湖南省茶葉研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 李勤輝

1.一種利用DNA條形碼鑒別茶樹品種的方法，包括以下步驟：

（1）DNA提?。悍謩e提取數個茶樹品種的DNA；

（2）引物篩選：篩選條帶清晰、穩定且重復性好的數對SSR引物；

（3）PCR擴增：將上述提取的DNA中的每個DNA分別與每對篩選的SSR引物混合配成PCR反應試劑進行擴增；

（4）SSR標記的PCR產物分析：將每一PCR反應產物進行凝膠電泳后染色，然后采用凝膠成像儀拍照記錄；

（5）分子條形碼的構建：將上述記錄的每對SSR引物上每一個品種的電泳圖上清晰的條帶記為“1”，同一位置無帶或不易分辨的弱帶計為“0”，建立原始數據庫；然后把每對SSR引物上每一個品種位點的1、0數據轉換為字母；再將數對SSR引物上對應品種轉換的字母進行組合，形成每一個品種的DNA條形碼；

（6）鑒別：以上述DNA條形碼為標準鑒別茶樹品種的真偽。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于：采用試劑盒法提取DNA。

3.根據權利要求2所述方法，其特征在于：篩選出

F:CTCCGATTACTTTCTTCC

R:GCAGGTTAGCGGTGGTTA；

F:TAGGGTTTTAGTTTCAG

R:AACATCCTTGCCTCGTC；

F:GTGAAGTTAGTTGTTACTCTTTTTTGG

R:AGGGGAAGTGAGGAGGCAT；

F:ATGCTTCAGGGAGTGACCAT

R:ATTTATGCCAAACTACCAACAG

四對SSR引物。

4.根據權利要求3所述方法，其特征在于：每一PCR反應試劑按體積份數6.65份?ddH₂O、1.0份10ng/μL?的上述提取的一個DNA、1.0份10×Buffer、0.7份25?mM的Mg²⁺、0.2份10?mM的dNTP、各0.1份10?μM的primers和0.25份2U/μL的Taq?polymerase混合配成而成。

5.根據權利要求4所述方法，其特征在于：PCR擴增條件為94℃變性3?min，然后94℃變性30?s，53℃退火30?s，72℃延伸50?s，共30個循環，完成以上循環以后，72℃延伸10?min，最后將PCR產物冷卻到室溫或者4℃。

6.根據權利要求5所述方法，其特征在于：上述PCR擴增重復一次，比較兩次擴增結果，如果兩次結果不一致，PCR擴增再重復一次，以有兩次擴增一致的結果為準。

7.根據權利要求6所述方法，其特征在于：將PCR反應產物與6×loading?buffer混合，采用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后進行硝酸銀染色，直到有清晰條帶出現為止。

8.根據權利要求7所述方法，其特征在于：硝酸銀染色的步驟為：①用10%乙醇和0.5%乙酸固定5～8?min；②用10%乙醇和0.5%乙酸再次固定5～8?min；③用0.2%AgNO₃染色10～15?min；④用蒸餾水沖洗數秒；⑤用1.5%NaOH和0.5%甲醛顯色。

9.根據權利要求7或8所述方法，其特征在于：?1、0數據轉換為字母的規則為：①有2個位點，按位點的大小只有第一個位點的編碼為A；只有第二個位點的編碼為B；兩個位點都有的編碼為C；兩個位點都沒的有編碼為N；②有3個位點，只有1個位點的按大小依次編碼為A、B、C；只有2個位點的，按位點組合依次編碼為D、E、F；三個位點都有的編碼為G；如果三個位點都沒有編碼為N；③有4個位點，只有1個位點的按大小依次編碼為A、B、C、D；只有2個位點則編碼字母從E開始，按位點組合依次編碼為E、F、G、H、I、J；只有3個位點的按位點組合從K開始依次編碼為K、L；4個位點都有的編碼為M，4個位點都沒有的編碼為N。