[發明專利]一種用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒

在審

• 申請號: 201510282511.1
• 申請日: 2015-05-28
• 公開（公告）號: CN104946792A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 黃曦;胡勝鋒
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝;鄭瑩

1.一種用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒，包括以下組分：（1）用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP特異性引物組；（2）逆轉錄酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反應液；（5）顯色劑；（6）陽性對照和陰性對照；其中，所述用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP特異性引物組包括：

內引物1：5’-?CGTTATTGGCGGAGCTACAGGGAGGCTATTGAAGTCAGGC-3’（SEQ?ID?No.1）；

內引物2：5’

-GTGGACTAGCGGTTAGAGGAGAGAGACTACAGCTTCATCTCAC-3’?（SEQ?ID?No.2）；

外引物1：5’-?GCTCCTTTCGAGAGTGAAG?-3’（SEQ?ID?No.3）；

外引物2：5’-GGTCTCCTCTAACCTCTAGTC-3’（SEQ?ID?No.4）；

環引物1：5’-CAGCACGGTTTGCTCAAG-3’（SEQ?ID?No.5）；

環引物2：5’-?CCTTACAAATCGCAGCAACAA-3’（SEQ?ID?No.6）。

2.根據權利要求1所述的用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述引物組中，內引物、外引物、環引物的摩爾比為6～8：1：3～4。

3.根據權利要求1所述的用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述逆轉錄酶為AMV逆轉錄酶；所述DNA聚合酶為Bst?DNA聚合酶。

4.根據權利要求1所述的用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述RT-LAMP反應液含有：10mM?dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、150mM?MgSO₄溶液、5mM?甜菜堿，四者的體積比為6～8：4～5：2～3：8～10。

5.根據權利要求1所述的用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述顯示劑為SYBR?GREENⅠ。

6.根據權利要求1所述的用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為含有4型登革熱病毒NS1基因片段（SEQ?ID?NO.7）的質粒，陰性對照為DEPC水。

7.一種快速鑒定登革熱病毒4型的方法，其特征在于，采用權利要求1～6任一項所述的試劑盒，加入模板RNA，在60～65℃，等溫擴增60～90分鐘，具體包括如下步驟：

（1）提取模板RNA；

（2）環介導等溫基因擴增反應：25μl反應體系含有：內引物1、2各7～9pmol/μl，外引物1、2各1～2?pmol/μl，環引物1、2各3～5?pmol/μl，反應液?12～13μl，DNA聚合酶7～9U，待檢RNA?1~100ng，逆轉錄酶1～2U，用滅菌去離子水補齊到25μl，然后加入18～22μl的密封液，將上述反應管于60~65℃反應60~90min；

（3）結果判斷：在上述反應管中加入1-2μl顯色劑10×SYBR?GREENⅠ，混勻后觀察反應液的顏色，若呈現綠色則為登革熱4型病毒，橙色則為非登革熱4型病毒。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，環介導等溫基因擴增反應的25μl反應體系含有：內引物1、2各8pmol/μl，外引物1、2各1?pmol/μl，環引物1、2各4?pmol/μl，反應液?12.5μl，DNA聚合酶8U，待檢RNA?1~100ng，逆轉錄酶1U，用滅菌去離子水補齊到25μl。