[發明專利]一種用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒

在審

• 申請號: 201510282511.1
• 申請日: 2015-05-28
• 公開（公告）號: CN104946792A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 黃曦;胡勝鋒
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝;鄭瑩

技術領域

本發明涉及病原微生物的檢測與鑒定，具體涉及一種用環介導等溫基因擴增技術（LAMP技術）快速鑒定4型登革熱病毒的方法。

背景技術

登革熱病毒（Dengue?virus，DENV）是一種黃病毒類RNA病毒，主要包括1～4型病毒（DENV?1～4）。登革熱病毒主要通過埃及伊蚊（Aedes?aegypti）和白紋伊蚊（Aedes?albopictus）傳播，登革熱病毒的感染可以引起登革熱（dengue?fever，DF），嚴重的還可導致登革出血熱（Dengue?hemorrhagic?fever，DHF）或登革休克綜合征（Dengue?shocksyndrome，DSS）等。DENV廣泛流行于全球的熱帶和亞熱帶地區，我國主要分布于廣東、海南、廣西、福建、臺灣等?。ㄗ灾螀^）。ENV-4型1979年從海南島儋縣北部白馬鎮開始沿西海岸向南北蔓延,波及堪江、佛山、廣州、汕頭、韶關等地區以及廣西的北海、合浦,連續流行3年。

目前登革熱病毒的鑒定方法主要為PCR，ELISA、免疫膠體金等方法。登革熱檢測常用的ELISA、免疫膠體金方法耗時長，通常需要5～7?d血清中才能達到抗體能夠檢測水平，同時登革熱抗體與其他黃病毒存在交叉反應，出現假陽性率較高，故血清學檢測作為登革熱病毒檢測局限性較大；DENV的分離可以很好的鑒定登革熱病毒，但同樣耗時長，敏感度又很低，也不可以作為早期檢測登革熱病毒的手段。近10?多年發展起來的DENV核酸檢測技術，為登革熱的早期診斷提供了可能，但PCR以及RT-PCR都需要昂貴的PCR儀作為基礎，也在一定程度上限制了PCR方法在鑒定登革熱病毒上的發展。

以上各種方法雖然可能在臨床上提供較好的價值，但因耗時長、繁瑣的操作過程、靈敏度低、需要昂貴的儀器設備等不同的原因未能在臨床上大規模推廣使用。環介導等溫基因擴增技術（Loop-Mediated?Isothermal?Amplification，以下簡稱LAMP法）是日本榮研化學株式會社于2000年前后開發出的基因擴增技術，其具有快速簡便、操作準確、容易普及、安全可靠的優點，目前尚未有將LAMP法應用于快速鑒定4型登革熱病毒。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于快速鑒定3型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒、以及一種用環介導等溫基因擴增技術（LAMP技術）快速鑒定4型登革熱病毒的方法。本鑒定方法方便快捷、價格低廉，適于推廣應用。

本發明所采取的技術方案是：

一種用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒，包括以下組分：（1）用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP特異性引物組；（2）逆轉錄酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反應液；（5）顯色劑；（6）陽性對照和陰性對照；其中，所述用于快速鑒定4型登革熱病毒的RT-LAMP特異性引物組包括：

內引物1：5’-?CGTTATTGGCGGAGCTACAGGGAGGCTATTGAAGTCAGGC-3’（SEQ?ID?No.1）；

內引物2：5’

-GTGGACTAGCGGTTAGAGGAGAGAGACTACAGCTTCATCTCAC-3’?（SEQ?ID?No.2）；

外引物1：5’-?GCTCCTTTCGAGAGTGAAG?-3’（SEQ?ID?No.3）；

外引物2：5’-GGTCTCCTCTAACCTCTAGTC-3’（SEQ?ID?No.4）；

環引物1：5’-CAGCACGGTTTGCTCAAG-3’（SEQ?ID?No.5）；

環引物2：5’-?CCTTACAAATCGCAGCAACAA-3’（SEQ?ID?No.6）。

所述引物組中，內引物、外引物、環引物的摩爾比為6～8：1：3～4。

所述逆轉錄酶為AMV逆轉錄酶；所述DNA聚合酶為Bst?DNA聚合酶。

所述RT-LAMP反應液含有：10mM?dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、150mM?MgSO₄溶液、5mM?甜菜堿，四者的體積比為6～8：4～5：2～3：8～10。

所述顯示劑為SYBR?GREENⅠ。

所述陽性對照為含有4型登革熱病毒NS1基因片段（SEQ?ID?NO.7）的質粒，陰性對照為DEPC水。