[發明專利]一株重組大腸桿菌的構建及其合成(S)-2-羥基-3-苯基丙酸的方法

在審

• 申請號: 201510279435.9
• 申請日: 2015-05-27
• 公開（公告）號: CN104878024A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發明（設計）人: 朱益波;王立梅;齊斌;王穎;梁劍光
• 申請（專利權）人: 常熟理工學院
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術領域

????本發明屬于生物技術領域，特別涉及一株重組大腸桿菌的構建及其合成?(S)-2-羥基-3-苯基丙酸的方法。

背景技術

苯乳酸(phenyl?lactic?acid，PLA)，即2-羥基-3-苯基丙酸，3-苯基乳酸或β-苯乳酸。PLA為淡黃色粉末，略有特殊性氣味，分子式為C₉H₉O₃，相對分子量為166，熔點121~125?℃，對酸和熱穩定。PLA是近年來發現的一種新型天然防腐劑，廣泛存在于乳酸菌發酵產品和蜂蜜中，是由多種微生物(主要是乳酸菌)中苯丙氨酸的代謝產物。這種由公認為安全的乳酸菌代謝產生的芳香族有機酸經研究表明對人和動物細胞無毒。PLA是繼乳酸菌產生的第一代抑菌物質如乳酸、醋酸和第二代抑菌物質如乳酸鏈球菌素(nisin)、片球菌素(pedioein)等細菌素以外的第三代天然小分子抑菌物質。與多數天然防腐劑相比，苯乳酸抑菌譜更廣，能抑制多種食源性致病菌、腐敗菌，特別是能抑制真菌污染，是使乳酸菌發酵產物抗真菌性強和較長貨架期的主要活性物質之一；溶解性好，易于在食品體系中擴散；穩定性高，具有寬廣的pH范圍和熱穩定性，這些優點利于其在食品工業具有廣闊的應用前景。

PLA第二個碳原子為手性碳原子，因此有(S)-2-羥基-3-苯基丙酸，即L-PLA和(R)-2-羥基-3-苯基丙酸，即D-PLA兩種對映異構體，而兩種異構體對生物體的作用及其在醫藥、化工方面的應用有顯著差異，因此獲得光學純度高的單一對映體PLA是其在食品和醫藥領域廣泛應用的前提。

前期研究發現一些芽孢桿菌屬細菌如Bacillus?megaterium?Z2013513?(CCTCC?NO:M2013244)具有較乳酸菌相比更強的PLA合成能力，并且因其營養要求低、生長迅速、安全性好而具有良好的開發潛力。但由于芽孢桿菌屬特有的芽孢形成和同類相食效應，抑制了PLA合成能力的進一步提高，且只能催化產生D-PLA，但不能產生L-PLA。如果能夠進一步提高微生物合成L-PLA生產效率及高密度細胞生物合成L-PLA將具有非常重要的意義。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種L-乳酸脫氫酶基因，解決目前芽孢桿菌屬細菌合成PLA生產效率較低，只能催化產生D-PLA，但不能產生L-PLA的問題。

本發明的第二目的是提供攜帶上述的L-乳酸脫氫酶基因的重組表達質粒。

本發明的第三目的是提供含有上述重組質粒的重組大腸桿菌。

本發明的第四目的是提供上述重組大腸桿菌的構建方法。

本發明的第五目的是提供上述重組大腸桿菌的用途。

本發明的第六目的是提供上述重組大腸桿菌轉化苯丙酮酸合成L-苯基乳酸的方法。

本發明通過以下技術方案來實現：

一、一種L-乳酸脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

二、攜帶上述的L-乳酸脫氫酶基因的重組表達質粒pET-28a-ldhL。

三、含有上述的載體的重組大腸桿菌。

四、上述的重組大腸桿菌的構建方法，該方法包括以下步驟：

（1）根據大腸桿菌的密碼子偏好性對巨大芽孢桿菌（Bacillus?megateriumZ2013513）CCTCC?NO：M?2013244?L-乳酸脫氫酶基因進行密碼子優化；

（2）將密碼子優化的L-乳酸脫氫酶基因導入pET-28a(+)載體得到重組表達載體pET-28a-ldhL；

（3）將得到的重組表達載體pET-28a-ldhL轉化E.?coli?BL21(DE3)后得到重組大腸桿菌。

五、上述的重組大腸桿菌在轉化苯丙酮酸合成(S)-2-羥基-3-苯基丙酸中的應用。

六、上述的重組大腸桿菌轉化苯丙酮酸合成(S)-2-羥基-3-苯基丙酸的方法，該方法包括以下步驟：

（1）全細胞菌懸液制備，將重組大腸桿菌單菌落接種至種子培養基中活化，再將此種子液接種至擴大培養基中培養至對數中期，添加產酶誘導劑IPTG，低溫誘導并收集菌體以獲得全細胞菌懸液；

（2）流加底物苯丙酮酸和葡萄糖，全細胞生物轉化合成(S)-2-羥基-3-苯基丙酸。