[發明專利]一種合成西那普肽的方法

有效

• 申請號: 201510274315.X
• 申請日: 2015-05-26
• 公開（公告）號: CN104817631B
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 文永均;郭德文;董華建;曾德志
• 申請（專利權）人: 成都圣諾生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K1/20;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

1.一種合成西那普肽的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、將保護的Lys與樹脂偶聯，獲得在Lys的N端及其側鏈上偶聯有保護基、在其C端偶聯有樹脂的肽樹脂1；

步驟2、將在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶聯有保護基的多肽片段1的C端與肽樹脂1的N端進行偶聯，而后將保護的Lys再與片段1的N端偶聯，獲得在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Lys側鏈上偶聯有保護基，在C端偶聯有樹脂的肽樹脂2；

步驟3、將在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶聯有保護基的多肽片段1的C端與肽樹脂2的N端進行偶聯，而后將保護的Lys再與片段1的N端偶聯，獲得在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列N端、Lys側鏈上偶聯有保護基，在C端偶聯有樹脂的肽樹脂3；

步驟4、將在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶聯有保護基的多肽片段1的C端與肽樹脂3的N端進行偶聯，而后將保護的Lys再與片段1的N端偶聯，獲得在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列N端、Lys側鏈上偶聯有保護基，在C端偶聯有樹脂的肽樹脂4；

步驟5、將在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶聯有保護基的多肽片段1的C端與肽樹脂4的N端進行偶聯，而后將保護的Lys再與片段1的N端偶聯，獲得在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列N端、Lys側鏈上偶聯有保護基，在C端偶聯有樹脂的西那普肽樹脂；

步驟6、西那普肽樹脂酸解脫除C端樹脂和所有保護基得到西那普肽粗品，粗品純化轉醋酸鹽，獲得西那普肽成品，所述酸解采用由體積百分比為80-95％的TFA、體積百分比為1-10％的EDT、余量為水組成的混合酸解液酸解。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述保護的Lys為在其N端和側鏈偶聯有保護基的Lys。

3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，所述保護的Lys為在其N端偶聯有Fmoc保護基、在其側鏈偶聯有Boc保護基的Lys，即Fmoc-Lys(Boc)-OH。

4.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟1所述偶聯采用偶聯試劑偶聯，所述偶聯試劑為N,N-二異丙基乙胺、N,N-二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑/4-N,N-二甲基吡啶兩種之一。

5.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述樹脂為Trityl-Cl類樹脂或羥基類樹脂。

6.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2至步驟5所述偶聯均采用縮合試劑和活化試劑偶聯，所述縮合試劑為N,N-二異丙基碳二亞胺、N,N-二環己基碳二亞胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有機堿、2-(7-氮雜-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有機堿、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽/有機堿、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有機堿中的一種；所述活化試劑為1-羥基苯并三唑或N-羥基-7-氮雜苯并三氮唑。

7.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟6所述粗品純化轉醋酸鹽具體為：

西那普肽粗品溶解后采用高效液相色譜法進行純化，獲得西那普肽純化中間體濃縮液，然后以流動相系統為1％醋酸/水溶液-乙腈，以高效液相色譜法進行轉醋酸鹽。

8.根據權利要求7所述方法，其特征在于，步驟6所述粗品純化轉醋酸鹽具體為：

西那普肽粗品，用水溶解，溶液用0.45μm混合微孔濾膜過濾，純化備用；

采用高效液相色譜法進行純化，純化用色譜填料為10μm的反相C18，流動相系統為0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度系統洗脫，循環進樣純化，取粗品溶液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰蒸去乙腈后，得西那普肽純化中間體濃縮液；

取西那普肽純化中間體濃縮液，用0.45μm濾膜濾過備用；

采用高效液相色譜法進行換鹽，流動相系統為1％醋酸/水溶液-乙腈，純化用色譜填料為10μm的反相C18，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min；采用梯度洗脫，循環上樣方法，上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，采集圖譜，觀測吸收度的變化，收集換鹽主峰并用分析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液，減壓濃縮，得到西那普肽醋酸水溶液，冷凍干燥，得西那普肽成品。