[發(fā)明專利]一種胃蛋白酶原Ⅰ酶促化學發(fā)光檢測試劑盒在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510268536.6 | 申請日： | 2015-05-22 |
| 公開（公告）號： | CN104965077A | 公開（公告）日： | 2015-10-07 |
| 發(fā)明（設計）人： | 王明麗;洪葉;趙俊;劉峰 | 申請（專利權(quán)）人： | 必歐瀚生物技術(shù)（合肥）有限公司;劉峰 |
| 主分類號： | G01N33/543 | 分類號： | G01N33/543;G01N33/573;G01N21/76 |
| 代理公司： | 安徽合肥華信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34112 | 代理人： | 余成俊 |
| 地址： | 230088 安徽省合肥市高*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 胃蛋白酶 化學 發(fā)光 檢測 試劑盒 | ||
1.一種胃蛋白酶原Ⅰ酶促化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括酶標液、胃蛋白酶原Ⅰ標準品、包被胃蛋白酶原Ⅰ單克隆抗體的免疫磁珠、樣本稀釋液、化學發(fā)光底物液、洗滌液。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種胃蛋白酶原Ⅰ酶促化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于，將胃蛋白酶原Ⅰ單克隆抗體包被在磁珠微球表面，經(jīng)捕捉樣本中的胃蛋白酶原Ⅰ以及加入酶標胃蛋白酶原Ⅰ單克隆抗體試劑后，形成固相-抗體-抗原-酶標抗體夾心免疫復合物。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種胃蛋白酶原Ⅰ酶促化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于，所述的包被胃蛋白酶原Ⅰ單克隆抗體的免疫磁珠為含有標記有抗胃蛋白酶原Ⅰ單克隆抗體的磁性微球；
?所述的酶標液中酶標抗體的酶是辣根過氧化物酶；
?所述的洗滌液是含有吐溫-20的緩沖液；
?所述的化學發(fā)光底物溶液是酶促化學發(fā)光底物溶液。
4.如權(quán)利要求1-3任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述包被胃蛋白酶原Ⅰ單克隆抗體的免疫磁珠按如下方法制得：
（1）初洗緩沖液的配制：
稱取0.1952g的MES?hygrate于100ml的純水中，調(diào)整pH至5.0；
加入50μl吐溫-20，配成0.01mol/L?MES緩沖液，調(diào)整pH至5.0；
（2）偶聯(lián)緩沖液的配制：
稱取0.38138g?Na2B4O7·10H2O溶于40ml純水中，得到0.05mol/L的硼砂溶液；
稱取0.1237g?H3BO3溶于10ml純水中，得到0.2mol/L的硼酸溶液；
取18ml?0.05mol/L的Na2B4O7溶液與2ml?0.2mol/L的H3BO3溶液混合，定容至80ml得0.05mol/L硼酸緩沖液；
（3）終洗液的配制：
稱取2.78g?Na2HPO4溶于100ml純水得0.2mol/L?Na2HPO4溶液；
稱取1.2g?NaH2PO4溶于50ml純水得0.2mol/L?NaH2PO4溶液；
取81ml?0.2mol/LNa2HPO4溶液與19ml?0.2mol/L?NaH2PO4溶液混合，得0.2mol/L?PB緩沖溶液得0.2mol/LPB緩沖溶液；
取50ml?0.2mol/L?PB緩沖液，2倍稀釋到100ml，加入0.9gNaCl,?0.5g0.5%-1%的BSA，0.02-0.03%生物防腐劑、0.05%吐溫20，充分溶解混勻；
（4）封閉液的配制：
取100ml?Tris緩沖液，將溶液的pH調(diào)節(jié)成8.5-9.0之間；
向其中加入2%BSA；
（5）?EDC溶液和NHS溶液的配制：
稱取25mg/ml的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺，溶解于1ml的初洗緩沖液中，配制成25mg/ml的EDC溶液；
稱取25mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺溶解于初洗緩沖液中，配置成25mg/ml?NHS溶液；
（6）磁珠包被過程：
A、初洗：取100μl磁珠，將其稀釋成10mg/ml的磁珠濃度，從中吸取100μl；磁分離架上分離，去上清；用初洗液250μl洗滌三次，磁分離，去上清；
B、活化：取初洗完成的磁珠加入150μlMES，再加入50μl?EDC及50μl的NHS溶液，充分混勻；室溫下25℃活化30min，活化完成磁分離去上清，以250μl偶聯(lián)緩沖液重懸洗滌三次，分離去上清；
C、稀釋抗G-17單克隆抗體：
將抗G-17單克隆抗體從-20℃冰箱中取出，待其融化后取出20μl，用偶聯(lián)緩沖液1:20稀釋到400μl，稀釋后的抗體濃度為0.0397mg/ml；
D、偶聯(lián)：
加入400μl用偶聯(lián)緩沖液稀釋的抗G-17單克隆抗體重懸活化后的磁珠，充分混勻，其磁珠包被比率為1mg磁珠：0.0159mg抗體；
37℃偶聯(lián)2h，37℃搖床搖晃恒溫混勻；
E、封閉：
將偶聯(lián)結(jié)束的磁珠于磁分離架上分離，去上清；
加入400μl封閉液，37℃搖床封閉1h；
封閉結(jié)束后去除上清；
F、終洗保存：
以400μl終洗液洗滌封閉完成的磁珠，重復三次，最終定容到500μl。
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