[發明專利]用于制備PAP固體反應成分的冷凍干燥技術及由該技術獲得的固體集成組合物與應用

在審

• 申請號: 201510259340.0
• 申請日: 2015-05-20
• 公開（公告）號: CN104894105A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 丁少峰;劉強
• 申請（專利權）人: 丁少峰;劉強
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;F26B5/06
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

技術領域

本發明涉及分子生物學和核酸擴增領域，尤其是用于制備PAP固體反應成分的冷凍干燥技術及由該技術獲得的固體集成組合物與應用。

背景技術

現階段用于核酸擴增的技術包括焦磷酸化激活性聚合反應(PAP)。PAP是通過使用3'末端阻斷性引物,由DNA聚合酶把焦磷酸化反應和聚合反應串聯耦合的一種核酸擴增方法。引物在其3′末端被一個不可延伸的核苷酸(3′末端阻斷劑)所阻斷，如雙脫氧核苷酸，而不能被DNA聚合酶直接延伸。當3′末端阻斷性引物退火與其互補的DNA模板相配時，在焦磷酸或其類似物存在的條件下，DNA聚合酶可以將3'末端阻斷性引物的3′阻斷劑除掉，這一反應稱為焦磷酸化。然后DNA聚合酶可將結合到DNA模板上3′末端已解除阻斷的引物進行延伸。此外，PAP已經在美國專利號6,534,269,7,033,763,7,105,298,7,238,480,7,504,221,7,914,995,and?7,919,253有所描述。

PAP使用了3'末端阻斷性引物串聯耦合了焦磷酸化反應和延伸性聚合反應而產生了非常高的選擇性，因為一個顯著的非特異性擴增(第二類錯誤)需要不匹配性焦磷酸化反應并加上隨后由DNA聚合酶延伸摻入錯誤匹配的脫氧核苷酸,這類串聯耦合事件的發生概率極低,估計為3.3×10^-11。

雙向形式的PAP(雙向PAP)使用兩個相反方向的3'末端阻斷性引物并在其3'末端有一個核苷酸相互重疊，雙向PAP特別適合于等位基因的特異性擴增。在10⁹個拷貝的野生型DNA存在的條件下，雙向-PAP能夠檢測出單一拷貝的突變型等位基因而沒有假陽性擴增。

DNA-PAP是指從DNA模板開始的PAP擴增。對于DNA-PAP的相關報道表明，PAP最初的測試使用了Tfl和Taq聚合酶于人類多巴胺D1基因DNA模板，證明了DNA依賴性DNA焦磷酸化反應和DNA依賴性DNA聚合反應可以串聯耦合的原理。在用于其它DNA模板的情況下，還證明了使用一個由基因工程技術優化后含F667Y突變的聚合酶TaqFS時，PAP的效率大大提高。

而RNA-PAP是指從RNA模板開始的PAP擴增。對于RNA-PAP的相關報道則表明，RNA-PAP的發明可以直接擴增RNA模板而無需額外的處理。RNA-PAP帶來了一個RNA模板擴增的新機理，當阻斷性引物退火雜交至RNA模板上時,RNA依賴性DNA聚合酶焦磷酸化反應除掉3′阻斷劑,例如3′雙脫氧核苷酸，然后RNA依賴性DNA聚合酶將活化的引物延伸。同樣由于這種串聯耦合，RNA-PAP具有很高的選擇性來對抗RNA模板的不匹配，提供了高度特異的RNA模板的擴增(美國專利申請公開號20140186840)。

冷凍干燥是一個將材料冷凍然后降低周圍壓力使材料中的冰直接從固相到氣相升華的脫水過程。這一工藝被用于穩定逆轉錄酶和RNA聚合酶(美國專利號5614387)，凍干式PCR試劑(美國專利號5861251，6153412，WO專利申請公開號2005103277，EP專利號2202302)，和干燥式熒光Sanger測序分析試劑(美國專利號7407747)。然而，在多種組成成分存在的情況下，因為成分之間脆弱的平衡和相互作用，凍干的結果基本上是不可預知的。例如，據報道含有引物的干燥后的混合物可使Taq聚合酶失活(EP專利號2202302)，及鎂離子引發的非特異性反應導致假陽性擴增。

另外在實際工作中,PAP組合物以多種水溶液形式分別存儲,包括反應緩沖液、焦磷酸、dNTPs、3′阻斷性引物、聚合酶、及核酸模板等均被存儲在多個不同的試管內。操作時需要把PAP的各個組分從不同的試管移液加入到一個試管內，該操作過程既容易出錯且相當費時。

可見，尋求一種PAP組合物冷凍干燥技術具有非常重要的應用價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供用于制備PAP固體反應成分的冷凍干燥技術。

本發明所要解決的另一技術問題在于提供由上述液體集成組合物通過冷凍干燥技術所獲得的固體集成組合物。

本發明所要解決的另一技術問題在于提供由上述固體集成組合物的應用。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

用于制備固體PAP反應成分的冷凍干燥技術，包括：

a)提供了一個由液體集成組合物的水溶液，包括有I)反應緩沖液、3′阻斷性引物、脫氧核苷三磷酸、焦磷酸、熒光染料、聚合酶，但不含核酸模板，以及II)非還原性雙糖；