[發明專利]用于制備PAP固體反應成分的冷凍干燥技術及由該技術獲得的固體集成組合物與應用在審

申請號：	201510259340.0	申請日：	2015-05-20
公開（公告）號：	CN104894105A	公開（公告）日：	2015-09-09
發明（設計）人：	丁少峰;劉強	申請（專利權）人：	丁少峰;劉強
主分類號：	C12N15/10	分類號：	C12N15/10;F26B5/06
代理公司：	天津市三利專利商標代理有限公司 12107	代理人：	李蕊
地址：	美國加州高***	國省代碼：	美國;US
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摘要：
搜索關鍵詞：	用于制備 pap 固體反應成分冷凍干燥技術獲得集成組合應用
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【權利要求書】：

1.用于制備固體PAP反應成分的冷凍干燥技術，其特征在于：包括：

a)提供了一個由液體集成組合物的水溶液，包括有I)反應緩沖液、3′阻斷性引物、脫氧核苷三磷酸、焦磷酸、熒光染料、聚合酶，但不含核酸模板，以及II)非還原性雙糖；

b)將液體集成組合物的水溶液通過冷凍干燥技術獲得固體集成組合物,使其易于存儲和操作。

2.根據權利要求1所述的用于制備PAP反應成分的冷凍干燥技術，其特征在于:所述液體集成組合物的水溶液包括:反應緩沖液包含有Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄、和Mg⁺⁺；脫氧核苷三磷酸和焦磷酸為dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na₄O₇P₂或其類似物；熒光染料包括SybrGreen?I或連接于引物上的FAM；聚合酶包括含有F667Y氨基酸突變的Taq聚合酶；所述非還原性雙糖包括有海藻糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖或乳果糖。

3.根據權利要求1所述的用于制備PAP反應成分的冷凍干燥技術，其特征在于：所述液體集成組合物中還含有：

牛血清白蛋白；和/或

多元醇，所述多元醇為聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮；和/或

洗滌劑，所述洗滌劑為Tween-20或NP-40。

4.根據權利要求1所述的用于制備PAP反應成分的冷凍干燥技術，其特征在于：所述通過冷凍干燥技術獲得PAP固體集成組合物的方法還進一步包括步驟：c)冷凍干燥后,加入液體性核酸模板水溶液使得冷凍干燥獲得的固體集成組合物溶解。

5.根據權利要求1所述的用于制備PAP反應成分的冷凍干燥技術，其特征在于：具體步驟如下：

(1)準備水溶液，使每5-10微升的水溶液中含有176-352mM(pH值8.0、25℃)Tris-HCl、20-40mM(NH₄)₂SO₄、2.4-10mM?MgCl₂、50或90或100或180μM每一種dNTP、0.2-0.4μM每種引物、180-360μM?Na4PPi，0.2-0.4×SybrGreen?I染料，0.02-0.04％Tween-20，2單位聚合酶，200-400mM海藻糖，0-0.4％聚蔗糖-400，50-100g/ml?BSA，和0.5-1mM?DTT；

(2)冷凍干燥過程，使用冷凍干燥機進行冷凍干燥，具體條件為：在-50℃至-55℃快速冷凍2-4小時后，將樣品抽至0-15帕壓力真空并保持在-40℃至-45℃、15-30小時，然后逐漸升高溫度至室溫。

6.一種固體集成組合物，其特征在于：是由權利要求1-5之一所述冷凍干燥技術制備而得的。

7.根據權利要求6所述的固體集成組合物，其特征在于：具有組分如下：

反應緩沖液成分，包括Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄、和Mg⁺⁺；

脫氧核苷三磷酸和焦磷酸，為dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na₄O₇P₂或其類似物；

熒光染料，包括SybrGreen?I或連接于引物上的FAM；

聚合酶，包括含有F667Y氨基酸突變的Taq聚合酶；

雙糖，包括海藻糖，蔗糖，麥芽糖，纖維二糖，乳糖，或乳果糖。

8.根據權利要求6所述的固體集成組合物，其特征在于：還含有：

牛血清白蛋白；和/或

多元醇，所述多元醇為聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮；和/或

洗滌劑，所述洗滌劑為Tween-20或NP-40。