[發明專利]一種促進重組極端耐熱α-淀粉酶可溶性表達的方法

有效

• 申請號: 201510257537.0
• 申請日: 2015-05-19
• 公開（公告）號: CN105087520B
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發明（設計）人: 張毅;彭帥英;楊勝利
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/70
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明涉及一種促進重組極端耐熱α?淀粉酶可溶性表達的方法，將極端耐熱α?淀粉酶的編碼基因與分子伴侶蛋白Prefoldin的編碼基因共同表達，從而有效地提高了極端耐熱α?淀粉酶的可溶性表達與酶活性。

技術領域

本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種促進重組極端耐熱α-淀粉酶可溶性表達的方法。

背景技術

α-淀粉酶又稱為淀粉1，4-糊精酶，是一種內切酶，能隨機地切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內的α-1，4-糖苷鍵，產生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工業生產中應用最為廣泛的酶制劑之一。目前，α-淀粉酶已廣泛應用于變性淀粉及淀粉糖、焙烤工業、啤酒釀造、酒精工業、發酵以及紡織等許多行業和醫藥行業，是一種重要工業用酶。

耐高溫α-淀粉酶是工業上最常用的酶制劑之一。工業上現今常用的耐熱α-淀粉酶來源于Bacillus licheniformis(BLA)，其最適作用溫度為90℃而且需要與Ca²⁺作用來維持其熱穩定性。但該酶仍存在不足之處：首先，BLA的熱穩定性仍不夠高；其次，BLA的最適pH偏高為7.0-8.0；再次，BLA需要鈣離子來維持其熱穩定性。

重組極端耐熱α-淀粉酶PFA來源于極端嗜熱古菌P.furiosus，具有十分優秀的酶學性質與酶學特點，在多項關鍵指標方面遠優于目前市場上的傳統的耐熱α-淀粉酶。例如其最適溫度接近100℃，并具有極其優良的耐熱性，在100℃數小時不喪失活性(一般耐熱淀粉酶如BLA在接近100℃時的半衰期僅有數分鐘)。同時，極端耐熱α-淀粉酶PFA的活性與耐熱性均不需要另外添加鈣離子，且其最適pH為酸性，可以大大便利工業應用過程中的后續環節。另外，該酶的淀粉水解產物主要成分為麥芽寡糖，以G2-G7為主，單糖(葡萄糖)含量低于2％。這些優點與特點提示重組PFA有望在包括淀粉高溫液化、超高純度高麥芽糖漿的生產以及紡織印染等等多種工業化生產過程中發揮卓越的作用，具有極高的潛在工業應用價值。

P.furiosus是從海底火山溫泉中的分離得到的絕對厭氧菌，最適生長溫度100℃[Haruyuki Atomi等，Current Opinion in Biotechnology，2011，5(22)：618-626]，培養相對較為復雜，難以實現大規模工業培養，PFA的較大量制備只能通過外源重組表達方能夠實現。迄今已有多家國內外實驗室對PFA的蛋白結構、酶學性質以及重組表達等方面進行了研究，至今尚未有適合該酶大規模制備方法的報道。國外的研究結果與本發明人對PFA的研究結果發現當重組PFA在E.coli中大量表達時，表達的重組PFA主要是不溶性的包涵體，這為該酶的大規模純化與制備等下游工程帶來了極大的不便。

本發明人前期對重組極端耐熱alpha-淀粉酶PFA進行了較為深入的研究。首先研究了重組PFA在大腸桿菌中進行大量表達，發現重組PFA主要以不溶性的包涵體形式表達。之后對PFA包涵體純化復性的方法進行了研究，建立了堿變性-加熱-稀釋復性的純化方法，獲得了具有較高生物活性的重組PFA[Lisa Wang等，J Ind Microbiol Biotechnol.2007.(34):187–192；張毅等，中國發明專利：一種嗜熱α-淀粉酶的制備純化方法，專利號：ZL20061 0025974.0]。在進一步對純化酶的穩定性研究過程中發現，一定濃度的去垢劑對重組PFA的酶活性沒有影響，由此建立了采用去垢劑對重組PFA包涵體進行溶解復性與純化的方法[張毅等，中國發明專利：重組極端耐熱α-淀粉酶的復性與純化方法，專利號：ZL200810039429.6]。

盡管如此，對于重組酶而言，可溶性表達更具應用與生產的便利性及生產成本的可控性。由于重組極端耐熱alpha-淀粉酶PFA自身的特性，現有技術中，對該酶實現可溶性的重組高表達十分困難。

因此，本領域還需要進一步研究適用于重組表達極端耐熱alpha-淀粉酶PFA的表達系統以及表達方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種促進重組極端耐熱α-淀粉酶可溶性表達的方法。