[發明專利]hTERT重組慢病毒永生化人脫落乳牙牙髓干細胞系的方法

在審

• 申請號: 201510256977.4
• 申請日: 2015-05-19
• 公開（公告）號: CN105063089A
• 公開（公告）日: 2015-11-18
• 發明（設計）人: 李昂;劉瑾;茍建重;尹戰海
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 西安智大知識產權代理事務所 61215
• 代理人: 弋才富

1.hTERT重組慢病毒永生化人脫落乳牙牙髓干細胞系的方法，包括以下步驟：

步驟一、原代人脫落乳牙牙髓干細胞(SHED)的原代培養：

收集兒童牙病科拔除的滯留乳切牙，超凈臺內用拔髓針盡量完整拔除牙髓組織，將3mg/ml的Ⅰ型膠原酶和4mg/ml的Dispase酶按照體積比為1:1加入培養皿中，用眼科剪將牙髓組織盡量剪碎，置于37℃,5％CO₂,飽和濕度的標準環境細胞培養箱消化60min至組織松散，每隔3-5d更換培養液一次，培養液成分為體積比79％的DMEM/F12培養基中加入體積比為20％的胎牛血清，體積比為1％的三抗混勻，待有細胞克隆出現，用濾紙片挑取細胞克隆擴大培養，擴大培養的方式是消毒干燥的濾紙片沾濕0.2％胰酶后于克隆位置消化5-10秒，利用濾紙片將消化下的細胞轉移至新的培養皿中繼續培養，得到的第2代生長狀態佳的人脫落乳牙牙髓干細胞SHED，態均一，呈短梭狀、多角形；

步驟二、穩定表達hTERT基因的永生化人脫落乳牙牙髓干細胞hTERT-SHED的構建：

取步驟一培養得到的第2代生長狀態佳的SHED消化后接種于24孔板，每孔500μL；24h后待細胞貼壁生長，然后再在每孔中加增強感染效率的試劑EnhancedinfectionsolutionENi.S.原液243.25μL、10mg/mL聚凝胺polybrene0.25μL，以及按照MOI＝65加入攜帶hTERT基因1*10⁵TU/μL的慢病毒原液6.5μL，混合均勻；24h后換正常培養液，2d后再換含有2μg/mL嘌呤霉素的培養基，隔2d用2μg/mL嘌呤霉素的培養基再換1次，培養觀察4d，待未感染細胞在嘌呤霉素作用下全部死亡，再換正常培養基靜置培養，每3d換液1次；直到有抗性細胞克隆出現，濾紙片挑取克隆進行擴大培養，得到穩定的感染細胞。