[發明專利]一種水稻工程保持系的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201510253259.1
• 申請日: 2015-05-18
• 公開（公告）號: CN104846009B
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發明（設計）人: 宋書鋒;李新奇;李莉;張大兵;符習勤;袁定陽;袁隆平
• 申請（專利權）人: 湖南雜交水稻研究中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;A01H1/02;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)11369
• 代理人: 史霞

技術領域

本發明涉及一種水稻工程保持系的構建方法及其應用。

背景技術

水稻雜種優勢利用是提高水稻產量最有效的途徑。“三系法”雜交水稻對種質資源利用率低以及“兩系法”雜交水稻雜交制種安全性約束是影響雜交水稻種植推廣面積進一步擴大的重要因素。發明新的育種技術,開發出對種質資源利用率高、雜交制種安全的水稻雜種優勢利用方法是雜交水稻發展的方向。普通隱性核不育材料不育性穩定、雜交制種安全，易于配制高產、優質、多抗組合；共同的缺點是無法實現不育系種子的批量繁殖。

針對隱性核雄性不育材料的繁殖問題，育種家也先后提出多種解決方案,主要包括：(1)根據雄性不育機理，通過施加缺失的代謝中間物質(如氨基酸、黃酮、脂肪酸等物質)，使突變不育株恢復育性而得以繁殖；(2)在雄性不育株中，利用條件控制(如誘導性)啟動子驅動育性恢復基因表達，給予適合的啟動子表達條件時，育性恢復基因表達,育性恢復而得以繁殖；而不給予適合啟動子表達的條件時，育性恢復基因不表達，即為不育系。此外，也可以利用條件控制啟動子驅動作物內源育性基因的抑制因子表達而達到上述同樣的目的。以上這些方案在不同作物的實際生產中得到了不同程度的應用，但由于不育系的育性轉換不能被完全精確地控制，或者不育系中含有轉基因成分并因而造成雜交種中含有轉基因等問題，都沒有得到廣泛的應用。

隨著分子設計育種思想和技術的進步，開發能夠精確控制的不帶轉基因成分的不育系的繁殖技術，成為分子設計雜交育種技術領域亟需解決的問題。1993年6月11日，國外生物技術公司PLANT GENETIC SYSTEM提出了一項PCT專利申請，該專利提出以下技術思想：在隱性雄性不育植株中導入連鎖表達的育性恢復基因、花粉致死(敗育)基因以及篩選標記基因(如熒光蛋白基因)三套元件，可以獲得該雄性不育植株的保持系，保持系通過自交就可以實現不育系和保持系的繁殖。2002年，Perez-Prat等人提出，可以通過在純合的雄性不育植株中導入連鎖表達的育性恢復基因和篩選標記基因兩套元件，由此獲得該雄性不育植株的保持系，保持系與不育株雜交即可繁殖不育系和保持系。兩種方法提出了利用精確的分子生物技術手段，解決隱性核雄性不育基因及不育材料的應用問題，為開展分子設計雜交育種提供了技術框架。相比較而言，三元件系統考慮到花粉逃逸和轉基因生態風險的問題,較雙元件系統思路更加縝密。2006年，美國杜邦先鋒公司在三元件系統技術思路基礎上，首先在玉米中實現了基于核不育突變材料的種子生產技術，并命名為Seed Production Technology(SPT)技術。2010年9月，在中國科技部“國家高技術研究發展計劃”的支持下，三元件系統技術思想在水稻中得到了證實和應用，并被稱之為“智能不育雜交育種技術”或“第三代雜交水稻技術”。通過項目的實施，將有力推動智能不育分子設計技術在作物育種中的研究應用，使我國在水稻雜交育種領域繼續保持國際領先優勢，為促進生物育種產業的發展提供技術和產品支持。

從思路上來說，SPT技術幾乎完美，既可以實現普通核不育系的繁殖，又可以消除人們對于轉基因風險的擔憂，因為雜交后代植株中沒有外源的轉基因元件，不存在轉基因生物安全問題。但是在實際操作過程中會遇到以下幾個問題：(1)轉化受體取材受到限制，因為互補載體要轉化到不育植株中去，因此只有選擇不育水稻植株的幼穗誘導愈傷組織；取材受到很大限制，并且有效取材時間很短；(2)育性恢復基因的導入對突變不育株的表型恢復并不十分理想，對于后續的制種產量影響很大。原因可能與載體序列在受體基因組上的插入位點有關，側翼序列的特征對育性恢復基因的表達水平可能會有影響。

發明內容

本發明的一個目的克服現有技術的不足，并提供至少后面將說明的優點。

本發明另一個目的是提供一種水稻工程保持系的構建方法，本發明通過CRISPR/Cas9系統將外源報告基因整合到野生型水稻的染色體上，解決了轉化受體材料受限制的問題。

本發明還有一個目的提高水稻工程保持系在水稻育種中的應用，本發明的水稻工程保持系可用于水稻普通隱性雄性核不育系繁殖中，培育后的水稻工程保持系產品可機械化、規模化應用于水稻普通核不育系的繁殖制種中，且過程簡單、操作方便。

為此，本發明提供的技術方案為：

一種水稻工程保持系的構建方法，包括：

步驟一、將外源報告基因定點整合到野生型水稻的染色體上得到含有外源報告基因的轉基因株系，其中，該外源報告基因與野生型育性調控基因能夠緊密連鎖遺傳；以及，之后進入步驟二，