[發明專利]一種水稻工程保持系的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201510253259.1
• 申請日: 2015-05-18
• 公開（公告）號: CN104846009B
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發明（設計）人: 宋書鋒;李新奇;李莉;張大兵;符習勤;袁定陽;袁隆平
• 申請（專利權）人: 湖南雜交水稻研究中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;A01H1/02;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)11369
• 代理人: 史霞

1.一種水稻工程保持系的構建方法，其特征在于，包括：

步驟一、將外源報告基因定點整合到野生型水稻的染色體上得到含有外源報告基因的轉基因株系，其中，該外源報告基因與野生型育性調控基因能夠緊密連鎖遺傳；以及，之后進入步驟二，

步驟二、將步驟一中得到的轉基因株系與純合隱性水稻普通雄性核不育株系雜交，篩選含有所述外源報告基因的株系即為所需要的水稻工程保持系，其中，該純合隱性水稻普通雄性核不育株系為所述育性調控基因突變體株系；

所述步驟一中，獲得含有外源報告基因的轉基因株系的具體方法包括：

(1.1)分析野生型水稻染色體上育性調控基因的上下游序列區域，取該區域內NGG前面的20bp作為靶位點區域，并設計與該靶位點區域配對的引物序列，在引物上游序列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物:

上游序列：5’–GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’

下游序列：5’–AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’，其中“N”指代堿基A、T、C或G；

(1.2)根據CRISPR/Cas9系統，將步驟(1.1)中的引物序列構建到pP1C.1載體上得到基因整合載體；

(1.3)將外源報告基因構建到植物表達載體上得到重組表達載體；

(1.4)將所述重組表達載體和所述基因整合載體共轉化野生型水稻，得到轉基因植株；

(1.5)在靶位點兩翼設計引物，以轉基因植株基因組進行擴增，若擴增產物片段大小與外源報告基因片段大小大致相等，則判定該植株為含有外源報告基因的水稻轉基因株系，并且在靶位點定點插入整合。

2.如權利要求1所述的水稻工程保持系的構建方法，其特征在于，在所述步驟一之前還包括：通過圖位克隆確定出純合隱性水稻普通雄性核不育株系中突變型育性調控基因在染色體上的位置。

3.如權利要求1所述的水稻工程保持系的構建方法，其特征在于，所述重組表達載體中，所述外源報告基因的核苷酸序列前構建有水稻胚乳特異性啟動子Gt1。

4.如權利要求1所述的水稻工程保持系的構建方法，其特征在于，所述育性調控基因為水稻EAT1基因。

5.如權利要求4所述的水稻工程保持系的構建方法，其特征在于，所述步驟(1.1)中的引物序列為：

上游序列：5’–GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT–3’

下游序列：5’–AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC–3’。

6.如權利要求1所述的水稻工程保持系的構建方法，其特征在于，所述外源報告基因為紅色熒光標記基因、紅色熒光蛋白標記基因、綠色熒光蛋白基因、或藍色熒光標記基因中的任意一種。

7.水稻工程保持系在水稻育種中的應用，其特征在于，所述水稻工程保持系由如權利要求1至6任一所述的方法獲得。