[發明專利]一種直接實時熒光定量PCR的方法

有效

• 申請號: 201510249614.8
• 申請日: 2015-05-15
• 公開（公告）號: CN104818338B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 王海濱;周其玲;馮小霞;陳廈;王棽;劉立明;李永利;馬洪濱;王雪飛;高志強;王嫣
• 申請（專利權）人: 王海濱
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司11257
• 代理人: 趙曉丹

技術領域

本發明屬于臨床分子生物學技術領域，具體地屬于臨床分子生物學檢測領域。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一種根據生物體內DNA復制性質而設計的體外快速擴增特定DNA序列的技術。PCR反應體系主要由核酸引物、4種dNTP、DNA聚合酶、模板DNA和PCR反應緩沖液體系組成。自美國Cetus公司人類遺傳室Kary Mullis及其同事于1985年發明聚合酶鏈式反應(PCR)以來，PCR技術及其衍生技術就被快速開發出來，并在多種核酸檢測中得到了廣泛的運用。尤其是病毒或其他病原體的檢測，當知道待檢病原某一特定基因片段時，即可利用特異性的引物對樣品中微量的目標DNA進行PCR擴增，使其達到檢測量，通過適當的檢測手段進行檢測，即可確定病原體的存在與否。

實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用DNA擴增過程中熒光信號的積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。與普通的PCR相比。實時熒光定量PCR技術具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點，實現了PCR的定量分析。

目前，無論臨床實驗室檢測還是疫情處理，傳染病病原的核酸熒光PCR檢測技術，均需經過核酸提取或純化過程，該過程需要專門的實驗室環境和相應設備，實驗操作人員需經專業培訓；另外，這樣的操作增加了實驗操作步驟，并延長了檢測時間。

因此，需要提供一種操作簡便、定量準確的熒光定量PCR方法。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題在于提供一種操作簡便、定量準確的病原檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明采用下述技術方案：

一種直接實時熒光定量PCR的方法，其包括如下步驟：

1)用熔點為58℃～60℃的石蠟油混合物包被聚苯乙烯微球，并置于PCR擴增管管底；所述石蠟油混合物包括石蠟油和樹脂；

2)混合熱啟動DNA聚合酶、引物和探針、pH值3.5～4.5乙酸緩沖液、氯化鎂、氯化鉀和dNTP即制得熒光PCR擴增試劑；

3)用所述石蠟油混合物封閉所述熒光PCR擴增試劑于步驟1)的PCR擴增管管底；

4)石蠟油冷凝后，加入核酸裂解試劑；

5)檢測樣品。

優選地，聚苯乙烯微球直徑為1～2mm。優選地，每個PCR管中微球數量為5-25個，更優選地為8-15個。

優選地，所述石蠟油為優質石蠟油；所述樹脂為安息香，石蠟油和安息香混合成熔點為58℃～60℃的石蠟油混合物。

其中所述熱啟動DNA聚合酶為熱啟動Taq DNA聚合酶。

熒光PCR擴增試劑的封閉方法為：將20～30μl所述熒光PCR擴增試劑分裝到步驟1)的PCR擴增管底，加入20～30μl 95℃溶化的固態石蠟油，來封閉熒光PCR擴增試劑。

步驟2)中熒光PCR擴增試劑中各成分的具體濃度范圍為本領域常規用量。

所述核酸裂解液位于已經封閉完好的固態石蠟油上層。所述核酸裂解液包括0.25N的氫氧化鈉和1％曲通100。優選地，核酸裂解液的加入量為20～30μl，更優選地為25μl。

完成步驟4)后，PCR管可以封蓋冷藏備用也可以立即使用。

利用本發明的直接實時熒光定量PCR的方法進行PCR定量檢測，包括如下步驟：

1)將待測樣本加入上述方法制備的PCR管的核酸裂解液中。

2)將PCR管放置于PCR儀中進行PCR擴增，并實時監測熒光信號。

為了更好的裂解樣品，低速離心PCR管，以減少管壁和管蓋上黏附的核酸裂解液，以充分裂解樣品，所述低速離心的轉速為100～500rpm/min。

所述待測樣品包括但不限于培養的細胞、細菌、血清、血漿、唾液、尿液或胸腹水等。優選地所述待測樣本體積為5～10μl。優選地，所述樣品加入核酸裂解液后，輕輕晃動使所述核酸裂解液與待測樣本充分混勻。

優選所述PCR擴增程序：56℃，5min；95℃，10分鐘；然后進行50循環的95℃，10秒鐘和61℃，30秒鐘。在61℃檢測熒光信號。PCR擴增程序主要依賴于DNA聚合酶和引物的退火溫度，擴增程序包括但不限于上述擴增程序。