[發明專利]一種應用BLU-V PMA技術快速判定奶及奶制品中副結核分枝桿菌存活狀態的方法

有效

• 申請號: 201510248077.5
• 申請日: 2015-05-15
• 公開（公告）號: CN104830950B
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 鞏紅霞;鞏強;張祖維;傅英文;賈廣樂;霍乃蕊;宋潔;王靜慧;劉曉琳;王芬;張敏愛;姚亞婷
• 申請（專利權）人: 鞏紅霞
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/689
• 代理公司: 太原高欣科創專利代理事務所(普通合伙) 14109
• 代理人: 冷錦超;王博飛

本發明公開了一種應用BLU?V PMA技術快速判定奶及奶制品中副結核分枝桿菌存活狀態的方法。根據GenBank已公布Map的（登錄號：AF286339）ISMAV2基因組序列，選取該基因的保守序列，設計TaqMan熒光探針及引物。將BLU?V系統作為光源應用于PMA技術中結合熒光定量PCR技術的優點，成功建立了一種快速檢測奶及奶制品中MAP活菌的方法。該方法操作簡單，快速且比較精確。

技術領域

本發明一種應用BLU-V PMA技術快速判定奶及奶制品中副結核分枝桿菌存活狀態的方法，屬于微生物檢測技術領域。

背景技術

副結核病（Paratuberculosis）是由副結核分枝桿菌，即鳥分枝桿菌副結核亞種（Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis,MAP）引起的一種以反芻動物為主的慢性消耗性傳染病，也稱Johne,s病。該病很難凈化，而且與人類的克羅恩氏（Crohn,s）病存在潛在的聯系，有研究表明人的這種嚴重的疾病可能是由于奶的巴氏消毒法不能夠完全殺滅該菌，且研究中發現幾乎44%的奶制品中都檢出副結核菌為陽性。隨著我國國民生活水平的不斷提高，牛奶需求量呈正指數增長，急需大量的優質、高產奶牛，促使近年來進口種牛驟增，迫切需要建立早期的快速、準確的副結核病診斷方法，以預防、凈化和根除該病，保護我國畜牧業的健康快速發展。

目前檢測副結核分枝桿菌的常見方法有細菌學診斷、免疫學診斷、分子生物學診斷。其中涂片鏡檢法不能鑒別出感染者體內的病原菌是否存活，細菌培養法存在難于培養且耗時長至少4-6周，藥敏試驗也耗時比較長的問題。補體結合實驗（CF）雖然對有臨床癥狀的病畜檢出率較高，但用于潛伏感染病例時效果不佳。瓊脂擴散試驗（AGID）方法敏感性低，不宜用作篩選和鑒定亞臨床感染病例。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）比較敏感，有希望作為常用的診斷法。近幾年，Nogva等人應用EMA-PCR技術來區分活菌和死菌。但是EMA具有一定的毒性，如果與細胞作用時間稍長就會嵌入活細胞的細胞膜與其DNA結合，從而影響，檢測結果。單疊氮丙啶（propidium mono azide,PMA）能夠通過細胞膜破損的死菌， 與 DNA 結合，使死菌 DNA 在 PCR 時不再擴增， 進而檢測活菌的信號。Tomas Garc?a-Cayuela[53]等利用PMA-qPCR方法對乳制品中的四種乳酸菌進行了定量檢測，PMA-PCR技術是目前最具應用前景的活菌檢測技術。目前未有人應用BLU-V PMA結合熒光定量PCR技術進行副結核分支桿菌的存活性的快速判定。

然而，光源類型也是影響PMA處理的一個重要因素，在以往實驗中對PMA進行處理時，所使用的光源都是600W的鹵素燈，雖然其造價合理，照明度充分，但是它達到峰值亮度的時間短，且受到空氣介質和樣品濁度的影響，都會使PMA的處理效果降低，導致試驗出現假陽性和假陰性的結果。

發明內容

本發明克服現有技術的不足，所要解決的技術問題是將BLU-V系統作為光源應用于PMA技術中，結合熒光定量PCR技術的優點，成功建立了一種快速檢測奶及奶制品中MAP活菌的方法。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為：一種應用BLU-V PMA技術快速判定奶及奶制品中副結核分枝桿菌存活狀態的方法，將BLU-V系統作為光源應用于PMA技術中；

所述的將BLU-V系統作為光源應用于PMA技術判定奶及奶制品中副結核分枝桿菌存活狀態的方法包括如下步驟：

a取待測樣品，液體樣品直接離心，固體樣品加蒸餾水溶解離心，14500r離心5min；離心完畢后，棄去上清，加入EBBuffer于沉淀中，混勻得菌懸液；