[發明專利]一種應用BLU-V PMA技術快速判定奶及奶制品中副結核分枝桿菌存活狀態的方法

有效

• 申請號: 201510248077.5
• 申請日: 2015-05-15
• 公開（公告）號: CN104830950B
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 鞏紅霞;鞏強;張祖維;傅英文;賈廣樂;霍乃蕊;宋潔;王靜慧;劉曉琳;王芬;張敏愛;姚亞婷
• 申請（專利權）人: 鞏紅霞
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/689
• 代理公司: 太原高欣科創專利代理事務所(普通合伙) 14109
• 代理人: 冷錦超;王博飛

1.一種應用BLU-V PMA技術快速判定奶及奶制品中副結核分枝桿菌存活狀態的方法，其特征在于將BLU-V系統作為光源應用于PMA技術中；

所述的將BLU-V系統作為光源應用于PMA技術判定奶及奶制品中副結核分枝桿菌存活狀態的方法包括如下步驟：

a取待測樣品，液體樣品直接離心，固體樣品加蒸餾水溶解離心，14500r離心5min；離心完畢后，棄去上清，加入EB Buffer于沉淀中，混勻得菌懸液；

b向步驟a的菌液中加單疊氮丙啶，使單疊氮丙啶的終濃度為10μg/mL，充分混勻，并設不加PMA的菌懸液作為對照；將EP管置于避光盒中，避光10min；取出EP管，將其放入BLU-V系統中，儀器的光強為100，作用20min，使PMA與死菌的DNA雙鏈結合；每隔2min取出EP管在漩渦振蕩儀上振蕩混懸一次，以增加結合率；

c步驟b結束后，取出EP管，14500r離心5min；離心完畢后，棄去上清；最后加入400μL的TE，再次重懸混勻；后續進行常規的DNA提取；

d以步驟c中提取的DNA為模板，進行熒光定量PCR檢測樣品中的目標菌，上下游引物及探針序列分別為

上游：5’-AACGAGGGGACGATGAGG-3’

下游：5’-CTGTGATGTAACGCGATTCG-3’

探針5’-FAM-CACGGCGTTGCTGATGTCCACC-TAMRA

熒光定量PCR反應體系為10×PCR Buffer: 500mM KCl,100mMTris-cl，pH8.3室溫下2.5μL，MgCl₂ 25mM 1.5μL，dATP,dCTP,dTTP,dGTP各3.2μmol,2.0μL，上下游引物10pmol各1.0μL，TaqDNA酶5U/μL,2.5μL，探針3pmol 1.0μL，模板DNA 2.0μL，ddH₂O 11.5μL，總反應體系25.0μL。

2.根據權利要求1所述的一種應用BLU-V PMA技術快速判定奶及奶制品中副結核分枝桿菌存活狀態的方法，其特征在于熒光定量PCR反應條件：93℃變性15s；56℃退火15s，68℃延伸30s，40個循環。

3.根據權利要求1所述的一種應用BLU-V PMA技術快速判定奶及奶制品中副結核分枝桿菌存活狀態的方法，其特征在于，確定TaqMan熒光定量PCR檢測的Ct值＜25時，結果判定為陽性；與未經PMA處理組相比， PMA處理后的Ct值比未經PMA處的Ct值要大于6個以上，判定奶樣中不含有活菌。