[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)移因子溶液及其制劑中游離氨基酸含量的高效液相色譜檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510246537.0
• 申請(qǐng)日: 2015-05-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104897832A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陶玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 金花企業(yè)(集團(tuán))股份有限公司西安金花制藥廠
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 徐文權(quán)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥分析領(lǐng)域，涉及一種利用高效液相色譜檢測(cè)轉(zhuǎn)移因子溶液及其制劑中游離氨基酸含量的方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)移因子(transter?factor，簡(jiǎn)稱TF)又稱傳輸因子，由具有細(xì)胞性免疫功能的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，作為一種特定的細(xì)胞因子參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，能提高動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)機(jī)體抗感染和防御能力。轉(zhuǎn)移因子屬于多肽類物質(zhì)，是由多核苷酸、多肽及其他成分組成的復(fù)合分子。其中小分子肽類物質(zhì)是轉(zhuǎn)移因子的功能標(biāo)示物，并作為其主要功效成分。而氨基酸是組成多肽的基本單元，是轉(zhuǎn)移因子的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)。因此，準(zhǔn)確測(cè)定轉(zhuǎn)移因子中的游離氨基酸含量對(duì)于優(yōu)化轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)工藝及控制產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的意義。

迄今為止，已有較多關(guān)于采用高效液相色譜法對(duì)轉(zhuǎn)移因子中游離氨基酸進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道，但由于轉(zhuǎn)移因子組分復(fù)雜，報(bào)道的檢測(cè)方法測(cè)定色譜圖中，存在相鄰組分峰間有較大程度重疊的情況，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)移因子溶液及其制劑中游離氨基酸含量的高效液相色譜檢測(cè)方法，其能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)移因子中游離氨基酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量，顯著改善相鄰組分峰間的重疊程度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

1)制備供試品溶液；

2)供試品溶液的衍生

精密量取所述供試品溶液2.0mL，并置于10mL具塞試管中；然后向所述具塞試管中加入0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液0.8～1.0mL以及1mol/L三乙胺乙腈溶液0.4～0.6mL并搖勻，然后于室溫下反應(yīng)1～2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用正己烷萃取，取萃取得到的下層溶液用濾膜過(guò)濾，收集濾液，得衍生后的供試品溶液；

3)測(cè)定

精密量取衍生后的供試品溶液，并注入高效液相色譜儀，以0.05～0.1mol/L醋酸鈉緩沖溶液為流動(dòng)相A，以甲醇、乙腈和水的混合液為流動(dòng)相B，利用流動(dòng)相A與流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出供試品中游離氨基酸含量，所述梯度洗脫中流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為：0min時(shí)為97:3，15min時(shí)為88:12，20min時(shí)為85:15，50min時(shí)為50:50，50.1min時(shí)為0:100，55min時(shí)為0:100，56min時(shí)為97:3，70min時(shí)為97:3。

所述供試品溶液的制備方法為：精密量取固體轉(zhuǎn)移因子制劑的水溶液、液體轉(zhuǎn)移因子制劑或轉(zhuǎn)移因子溶液并置于量瓶中，加水稀釋至刻度后搖勻，得供試品溶液。

所述供試品溶液中多肽的質(zhì)量濃度為0.4～0.6mg/mL。

所述高效液相色譜儀的色譜柱填充劑采用十八烷基硅烷鍵合硅膠；所述十八烷基硅烷鍵合硅膠的粒度為5～10μm，優(yōu)選5μm；所述色譜柱的內(nèi)徑為2～5mm，優(yōu)選4.6mm；所述色譜柱的長(zhǎng)度為10～30cm，優(yōu)選25cm。

所述流動(dòng)相A的pH值為6.0～6.5，優(yōu)選6.3(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值)；所述流動(dòng)相B中甲醇:乙腈:水的體積比為(15～25):(55～65):(15～25)，優(yōu)選為(20:60:20)。

所述檢測(cè)方法中，檢測(cè)波長(zhǎng)為210～320nm，優(yōu)選254nm。

所述檢測(cè)方法中，進(jìn)樣量為1～50μL，優(yōu)選2μL。

所述檢測(cè)方法中，洗脫流速為0.5～2mL/min，優(yōu)選1mL/min。

所述檢測(cè)方法中，柱溫為20～50℃，優(yōu)選35℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)至少在于：采用高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)移因子溶液及其制劑中游離氨基酸的含量，通過(guò)篩選流動(dòng)相組成以及梯度洗脫的體積比，使液相色譜圖中各氨基酸峰峰形好，分離度高，大大降低了相鄰組分峰間的重疊比例，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度，適用于轉(zhuǎn)移因子溶液及其相關(guān)制劑中的游離氨基酸的檢測(cè)，以便對(duì)轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)及其制劑實(shí)施有效的監(jiān)督控制。

通過(guò)篩選色譜柱、流動(dòng)相pH值、色譜柱柱溫等措施，進(jìn)一步確定了最優(yōu)檢測(cè)色譜條件，進(jìn)一步提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度，液相色譜圖中各氨基酸峰分離度得到提高。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中18種氨基酸對(duì)照品溶液的液相色譜圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)移因子溶液供試品的液相色譜圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)移因子口服溶液供試品的液相色譜圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)移因子膠囊供試品的液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是，這些實(shí)施例僅是用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。