[發明專利]一種龍眼肉蛋白多糖的檢測方法

有效

• 申請號: 201510245943.5
• 申請日: 2015-05-14
• 公開（公告）號: CN104865333A
• 公開（公告）日: 2015-08-26
• 發明（設計）人: 易陽;王宏勛;閔婷;侯溫甫;艾有偉;王麗梅
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 四川君士達律師事務所 51216
• 代理人: 芶忠義

技術領域

本發明屬于食品檢測領域，尤其涉及一種龍眼肉蛋白多糖的檢測方法。

背景技術

龍眼(Dimocarpus?longan?Lour.)俗稱桂圓，屬于無患子科龍眼屬常綠喬木，主要的商業種植在中國、泰國和越南。我國龍眼的種質資源豐富，種植面積和產量均居世界首位。由于龍眼果實采收季節性強且貯藏保鮮難度大，鮮果約70％在產地鮮銷，其余主要加工為干果、果脯和果汁等，經濟附加值較低。精深加工對龍眼產業的高效、持續發展十分迫切。

作為衛生部法定的藥食同源水果，龍眼在我國民間和傳統中醫中多用于治療或改善氣血不足、心悸怔忡、失眠健忘、貧血、脾虛泄瀉等癥狀，其功能活性成分的研究開發在食品、生物和醫藥領域引起廣泛關注。蛋白多糖是重要的生物大分子，在現代藥理學研究中表現出免疫調節、抗腫瘤、抗氧化和抗炎癥等多種功能活性。龍眼干果肉中蛋白多糖含量高達35％，碳水化合物部分主要由(1→6)-α-D-Glcp、(1→4)-β-D-Manp、(1→4)-β-D-Rhap和(1→5)-α-L-Araf等糖苷鍵組成，結合蛋白含量約5％。蛋白多糖是龍眼肉免疫調節的主要物質基礎，能顯著增強免疫抑制和正常小鼠的免疫系統功能，并能在體外直接刺激脾淋巴細胞和巨噬細胞活化。龍眼肉蛋白多糖作為天然免疫調節功能因子具有廣闊的開發利用前景。目前關于龍眼肉蛋白多糖的研究主要集中在提取分離、結構解析和活性評價，而對于其定量和定性檢測方法研究則未見報道。

現有技術存在的問題是：

(1)傳統的蛋白多糖定量檢測方法是通過苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法測定其多糖含量，再換算相應蛋白多糖含量。該類化學分光光度法方法雖然操作簡單，但極易受還原糖、低聚糖和其他多糖存在的干擾，而常用的樣品處理方法(如醇沉法和凝膠層析法等)也很難消除相近分子量的高分子碳水合物的干擾。

(2)傳統的蛋白多糖定性檢測方法主要通過分子排阻色譜和示差檢測器相結合測定其分子量分布，該方法需要較高的目標物質濃度(即檢出限低)，且相近分子量的高分子物質都可能對檢測造成干擾。

(3)關于龍眼肉蛋白多糖的定性定量檢測方法尚未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種龍眼肉蛋白多糖的檢測方法，旨在解決現有的蛋白多糖的定性定量檢測方法檢出限高、靈敏度低、專一性不強的問題。

本發明是這樣實現的，一種龍眼肉蛋白多糖的檢測方法包括：

步驟一、取龍眼干果肉，加蒸餾水進行勻漿處理，龍眼肉勻漿保溫浸提后，抽濾分離濾液；濾液濃縮后，轉入截留分子量為3500的透析袋中，置于蒸餾水中低溫透析；透析袋內溶液真空濃縮后冷凍干燥，得到龍眼粗蛋白多糖粉末；

步驟二、取龍眼粗蛋白多糖溶于蒸餾水中，充分溶解后離心后取上清液加入Sephadex?G-100凝膠柱中，并以蒸餾水洗脫，采用苯酚硫酸法測定洗脫液中的多糖含量，測定洗脫液在280nm處的吸光值以表征其蛋白含量，收集合并同時出現多糖和蛋白信號的洗脫液，冷凍干燥得到龍眼肉蛋白多糖的純品；

步驟三、取龍眼粗蛋白多糖溶于碳酸鈉緩沖液中，加入異硫氰酸熒光素，于室溫下避光攪拌反應，反應結束后，離心取上清液加入Sephadex?G-100凝膠柱中，并以蒸餾水洗脫，采用苯酚硫酸法測定洗脫液中的多糖含量，并分別測定洗脫液在280nm和489.5nm處的吸光值以表征其蛋白和熒光素含量，收集合并同時出現多糖、蛋白和熒光素信號的洗脫液，冷凍干燥得到熒光標記龍眼肉蛋白多糖的純品；

步驟四、采用硝酸鈉溶液配制系列濃度的熒光標記龍眼肉蛋白多糖樣液，分別經0.45μm微孔濾膜過濾后采用液相色譜儀結合熒光檢測器分析，進行熒光標記龍眼肉蛋白多糖的標準曲線測定；

步驟五、以多糖濃度與峰面積對數對建立標準曲線進行定量分析，以響應峰的保留時間進行分子量的定性分析。

進一步，步驟一所述的龍眼肉勻漿在90℃下保溫浸提2小時。

進一步，步驟一所述的濾液在60℃下真空濃縮后，轉入截留分子量為3500的透析袋中，置于大量4℃蒸餾水中低溫透析12小時。

進一步，在步驟三中，龍眼粗蛋白多糖溶于0.5mol/L的pH為8.3的碳酸鈉緩沖液中，加入異硫氰酸熒光素后于室溫下避光攪拌反應24小時。

進一步，步驟四中采用0.1mol/L的硝酸鈉溶液配制系列濃度為0.5–200μg/mL的多糖樣液。