[發明專利]采用特異性引物鑒別汾遠2號遠志的方法

有效

• 申請號: 201510244426.6
• 申請日: 2015-05-13
• 公開（公告）號: CN104818337B
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 張福生;王丹丹;許曉雙;秦雪梅;張麗增
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司)14105
• 代理人: 張福增

技術領域

本發明涉及遠志的分子生物學檢測技術，具體地說是一種采用特異性引物鑒別汾遠2號遠志的方法。

背景技術

遠志來源于遠志科植物遠志Polygala tenuifolia Willd.和卵葉遠志P.sibirica L.的干燥根，為常用中藥，最早記載于《神農本草經》，被列為上品，并被視為養命要藥。性溫，味苦、辛，具有安神益智、祛痰、消腫的功能，經現代研究發現遠志具有抑菌、抗炎,提高認知、改善記憶能力、抗老年癡呆，抗抑郁，抗腫瘤，抗衰老等作用。遠志的主要有效成分為皂苷、口山酮、寡糖酯和生物堿等，其中：遠志皂苷為遠志中祛痰止咳、鎮靜的主要活性成分；遠志中糖酯類成分3，6＇-二芥子酰基蔗糖具有抗抑郁的作用；遠志糖酯A、C是遠志安神作用的物質基礎。近年來，由于遠志藥材使用量的不斷增加及其野生資源的不合理采挖，遠志藥材的野生貯藏量正逐年下降，已無法滿足人們日益增長的需求。從上世紀80年代起，就已經開始了野生遠志的馴化及人工種植，目前已形成遠志的多個規模化生產種植基地。但是傳統中藥材的生產種植由于無商品化的種子來源，目前仍處于一個粗放式的、自采自種的原始階段，因此，目前有必要且急需對現有商品遠志進行良種選育，進而為其規模化生產種植提供優良種質資源，使遠志藥材生產朝著優質、高產、質量穩定、可控的方向發展，實現資源的可持續發展。

晉遠1號和汾遠2號遠志(P.tenuifolia Willd.)是山西省農業科學院汾陽經濟作物研究所(以下簡稱汾陽經作所)選育的兩個遠志品種。晉遠1號和汾遠2號在形態學方面比較相近，晉遠1號：該品系株高35-45cm，葉色濃綠，鮮根圓株型，長25-30cm，直徑0.4-0.8cm，黃白色，粗細較均勻，抗根腐病、耐漬、耐旱性較強，生育期2.5年；汾遠2號：該品系株高25-35cm，葉色翠綠，鮮根圓柱形，花果全部集中于頂端。鮮根長28-32cm，直徑0.6-0.8cm，粗細均勻，根身與近蘆頭部位根皮顏色相近，黃白色，生育期2.5年，在以下性狀較親本(洪洞農家種：株高30-35cm，葉色深綠，鮮根圓柱形分枝較多，花果集中于地上部全株，鮮根長25cm-30cm)有明顯的區別。但是目前在藥材市場中流通的只是遠志藥材的干燥根，而且存在遠志根與筒的不同商品等級(如長短、粗細等)，因此僅僅依靠藥材的外形來辨別晉遠1號和汾遠2號存在著較大困難。

有學者曾針對遠志的基源和藥材進行過深入的研究，傳統的鑒定方法包括：基源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定以及理化鑒定等，現代的鑒別方法包括：色譜法、質譜法、核磁共振法、差熱分析法、掃描電鏡技術、電泳等。而隨著現代分子生物學技術的研究深入和發展，一些分子標記技術如限制性片段長度多態性(RFLP)分析、隨機擴增多態DNA(RAPD)分析、間斷簡單序列重復(ISSR)標記、擴增片段長度多態性(AFLP)分析等技術得到了廣泛的應用，但它們也存在著很多的不足。RFLP技術結果穩定，為共顯性表達，可以區分雜合、純和，但對DNA需求量較大且費用昂貴，操作復雜；RAPD具有廣泛性和通用性，具有對DNA的質量要求較低、技術簡便、檢測迅速、靈敏度高、可操作性強等優點，其缺點主要在于它是一個顯性標記，不能鑒別雜合子和純合子以及共遷移、重復性差等問題。ISSR標記具有快速、簡便、多態性高等優點，但其引物通用性差、擴增條件等需要針對性的設計；AFLP技術具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性，但對基因組DNA純度和內切酶質量要求較高，操作成本也相對較高，且所得到的分子標記多為顯性標記。核糖體基因轉錄間隔區(ITS)序列存在于高度重復的核糖體中，進化速度快且長度不大，加上協同進化使該片段在基因組不同單元間十分一致，因而適合進行各種分子操作。由于該區域受外界環境因素的影響較小，進化速度快，因而具有種內變異小而種間變異大的特點，是種類鑒定和系統發育分析的重要分子標記，可用于生物的分類、系統發育和遺傳多樣性的研究。

本發明結合以上方法和技術的優點，依據分子標記技術的原理和原則，設計出8對特異性PCR鑒別引物，目的是提出一種特異性鑒別汾遠2號遠志的分子方法，并希望得到實際應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種可快速、準確地鑒別汾遠2號遠志的特異性引物對，以及采用該特異性引物鑒別汾遠2號遠志的方法。

為實現本發明的目的，本發明提供的一種用于鑒別汾遠2號遠志的特異性引物對，所述的特異性引物對是如下(1)至(8)引物對中的任意一對：

(1)上游引物F1：5＇CGACCGTTGGACACGTATT 3＇