[發明專利]無外源誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法和應用

在審

• 申請號: 201510243732.8
• 申請日: 2015-05-13
• 公開（公告）號: CN104862279A
• 公開（公告）日: 2015-08-26
• 發明（設計）人: 劉妍;朱東亞;袁方;方愷恒;徐敏
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;A61K35/30;A61P25/28;A61P25/16;A61P25/08
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 李昊

1.一種無外源誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)在基質膠Matrigel或者Vitronectin的系統下培養人多能干細胞，直至達到60％-80％的密度；

2)將步驟1得到的人多能干細胞用Dispase或EDTA消化，然后當日以神經誘導分化懸浮液培養，該日記為第0天；

3)待可觀察到人多能干細胞形成的擬胚體球Embryoid?body?EB時，加入神經誘導分化液繼續培養；

4)第7天進行貼壁操作；

5)第10天加入音猬因子SHH或者小分子化合物Purmophine進行持續誘導；

6)第16天時將形成的類神經管結構吹下，并將吹下的類神經管結構用添加有SHH或Purmophine的神經誘導液持續誘導培養；

7)第22天即得所述GABA神經元。

2.根據權利要求1所述的無外源誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法，其特征在于，所述步驟2)中的神經誘導分化懸浮液為含有1％體積分數的N2supplement、0.1mMol/L非必須氨基酸的神經誘導分化液。

3.根據權利要求2所述的誘導人多能干細胞分化為GABA神經元方法，其特征在于，所述神經誘導分化懸浮液還包括0％—50％體積分數的無飼養層人多能干細胞培液E8。

4.根據權利要求1所述的無外源誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法，其特征在于，在所述步驟4)中，在貼壁前培養皿或培養板上提前鋪人源性的基質膠Vitronectin以促進其貼壁。

5.根據權利要求1所述的無外源誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法，其特征在于，所述步驟5)中加入含有100-1000ng/ml音猬因子SHH或者0.5-2μMol/L小分子化合物Purmophine的神經誘導液持續誘導6±1天。

6.根據權利要求1所述的無外源誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法，其特征在于，所述步驟6)中重懸后，加入含有100-1000ng/ml音猬因子SHH或者0.5-2μMol/L小分子化合物Purmophine的神經誘導液持續誘導10±2天。

7.根據權利要求1～6任一所述的無外源誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法直接得到的為GABA神經元作為移植治療神經退行性疾病藥物的應用。