[發明專利]無外源誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法和應用

在審

• 申請號: 201510243732.8
• 申請日: 2015-05-13
• 公開（公告）號: CN104862279A
• 公開（公告）日: 2015-08-26
• 發明（設計）人: 劉妍;朱東亞;袁方;方愷恒;徐敏
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;A61K35/30;A61P25/28;A61P25/16;A61P25/08
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 李昊

技術領域

本發明涉及一種無外源性高效誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法及應用，屬于生物醫學技術領域。

背景技術

近年來，隨著社會老齡化程度的加重，神經退行性疾病漸漸成為人們關注的焦點。由于人誘導多潛能干細胞技術的發展，以及動物實驗取得的初步成效，應用該技術治療中樞神經系統疾病展示出了廣闊的前景。

傳統觀點認為，成年哺乳動物神經元一旦受損就無法再生。這種觀點使許多神經退行性疾病的治療受到了極大的限制。雖然藥物及手術取得了進展，但仍無法獲得滿意的療效。目前，由于干細胞技術發展的日新月異，干細胞療法治療神經退行性疾病也日趨獲得了人們的重視。細胞移植是修復和替代受損神經組織的有效方法，能夠重建部分環路和功能，對神經系統疾病的治療具有深遠的意義。

許多神經性障礙由于大腦內興奮性神經元和抑制性神經元失衡所致異常放電導致。例如癲癇(Epilepsy)，精神分裂癥(Schizophrenia)，自閉癥(Autism)和阿爾茨海默病(Alzheimer's?disease,AD)等。大腦皮質中廣泛存在著兩種細胞，一種是興奮型投射神經元，另一種是抑制型中間神經元。大量的研究報道表明，大部分的神經性障礙及神經退行性疾病均與這兩種神經元之間有關。在大腦皮質中，廣泛存在著抑制型神經元γ-氨基丁酸神經元(GABA神經元)。GABA神經元起源于腹側胎腦，內神經節隆起(Medial?Ganglionic?Eminences,MGE)。作為一種典型的抑制型神經元，GABA神經元多被認為與學習記憶功能息息相關。在生長發育的過程中，GABA神經元通過長距離的切線遷移至大腦皮質。細胞移植可通過模擬及重塑神經環路為癲癇，帕金森病，情感障礙和神經痛等疾病提供新的治療方法。

近年來，人多能干細胞定方向分化領域發展迅速，由于其具有的自我更新，高度繁殖和分化潛能等特征，人們已經可以在體外培養出多種干細胞，并將其誘導成所需的細胞類型。隨著技術的進步和發展，已有文獻報道可將人多能干細胞分化至多種前腦腹側神經元。但現有的分化方法仍存在一些缺陷，包括培養液繁復，分化過程不能排除外源因素的干擾，分化效率不高等。以后若進一步應用細胞移植治療神經推行性疾病，排除外源因素的干擾是首要條件之一。

發明內容

發明目的：本發明的目的在于針對現有技術的缺陷，提供一種無外源誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法。具體涉及通過神經誘導培養液及Sonic?Hedge(SHH)或其激動劑小分子化合物Purmophomine使人多潛能干細胞分化至前腦γ-氨基丁酸能(GABAergic)中間神經元的方法。該方法可明顯改善培養液繁復，分化效率不高以及排除外源因素的干擾。

技術方案：本發明所述的無外源性高效誘導人多能干細胞為GABA神經元的方法，包括以下步驟：

1)在基質膠Matrigel或者Vitronectin的系統下培養人多能干細胞，直至達到60％-80％的密度；

2)將步驟1得到的人多能干細胞用Dispase或EDTA消化，然后當日以神經誘導分化懸浮液培養，該日記為第0天；

3)待可觀察到人多能干細胞形成的擬胚體球Embryoid?body?EB時，加入神經誘導分化液繼續培養；

4)第7天進行貼壁操作；

5)第10天加入音猬因子SHH或者小分子化合物Purmophine進行持續誘導；

6)第16天時將形成的類神經管結構吹下，并將吹下的類神經管結構用添加有SHH或Purmophine的神經誘導液持續誘導培養；

7)第22天即得所述GABA神經元。

進一步地，所述步驟2)中的神經誘導分化懸浮液為含有1％體積分數的N2培養基、0.1mMol/L非必須氨基酸的神經誘導分化液。

進一步地，所述神經誘導分化懸浮液還包括0％—50％體積分數的無飼養層人多能干細胞培液E8。

進一步地，其特征在于，在所述步驟4)中，在貼壁前培養皿或培養板上提前鋪人源性的基質膠Vitronectin以促進其貼壁。

進一步地，所述步驟5)中加入含有100-1000ng/ml音猬因子SHH或者0.5-2μMol/L小分子化合物Purmophine的神經誘導液持續誘導6±1天。

進一步地，所述步驟6)中重懸后，加入含有100-1000ng/ml音猬因子SHH或者0.5-2μMol/L小分子化合物Purmophine的神經誘導液持續誘導10±2天。