[發(fā)明專(zhuān)利]酶標(biāo)抗體?金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及暗場(chǎng)成像的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510243543.0
• 申請(qǐng)日: 2015-05-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104849449B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張宇;范霖;田艷艷;婁豆豆;張熙之;馬明;顧寧
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/543
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/543;G01N33/574;G01N33/535
• 代理公司: 南京蘇高專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32204
• 代理人: 沈振濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及暗場(chǎng)成像中的應(yīng)用，屬于納米材料及生物醫(yī)學(xué)納米技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

惡性腫瘤居高不下的死亡率和高昂的治療費(fèi)用給患者和家屬都帶來(lái)巨大的痛苦和壓力，準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法不僅可以實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷，也能更好地給患者提供個(gè)體化醫(yī)療，降低患者的痛苦。

現(xiàn)今，免疫酶標(biāo)法以其定位準(zhǔn)確、對(duì)比度高等優(yōu)點(diǎn)已成為臨床腫瘤診斷中不可缺少的重要診斷手段。其基本原理是先以功能性酶標(biāo)記的抗體與細(xì)胞或組織上的待測(cè)物質(zhì)直接或間接結(jié)合，接著加入酶的顯色底物，生成有色的不溶于水的產(chǎn)物，利用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡觀察，對(duì)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的待測(cè)抗原成分進(jìn)行定位研究。自2007年閻錫蘊(yùn)研究組首次提出氧化鐵納米顆粒模擬酶的概念，許多納米材料的類(lèi)酶特性被相繼發(fā)現(xiàn)，其中金納米顆粒作為一類(lèi)功能性納米顆粒，因其獨(dú)特的表面等離子體共振、表面化學(xué)特性和催化活性，在生物和化學(xué)檢測(cè)中被格外關(guān)注。金的氧化還原電位為+1.68，具有極強(qiáng)的奪電子能力。對(duì)于有氧化還原電位較小的生物大分子參加的生化反應(yīng)，具有很強(qiáng)的催化作用，能明顯提高生物大分子的活性，可催化H₂O₂氧化底物發(fā)生顯色反應(yīng)。但無(wú)論是傳統(tǒng)的酶標(biāo)二抗還是新興的金屬模擬過(guò)氧化物酶，催化活性都很有限，這就大大限制了臨床檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)，目前的免疫組化檢測(cè)為人工讀片，主觀性較強(qiáng)，準(zhǔn)確性得不到保證。

暗場(chǎng)顯微鏡以其分辨能力高等優(yōu)點(diǎn)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新的表征技術(shù)之一，金納米顆粒又以其優(yōu)越的暗場(chǎng)散射性質(zhì)在腫瘤成像方面的應(yīng)用獲得了科學(xué)家的認(rèn)可，國(guó)內(nèi)外很多研究組利用金納米顆粒的暗場(chǎng)散射性質(zhì)實(shí)現(xiàn)了惡性腫瘤的檢測(cè)。但金納米顆粒的散射強(qiáng)度有限，當(dāng)單獨(dú)使用金納米顆粒標(biāo)記腫瘤細(xì)胞或組織進(jìn)行暗場(chǎng)觀察難以達(dá)到臨床檢測(cè)的要求。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及協(xié)同增強(qiáng)暗場(chǎng)成像中的應(yīng)用。該方法通過(guò)將金納米顆粒作為?大量酶標(biāo)二抗的載體同時(shí)利用其本身的類(lèi)酶活性和暗場(chǎng)散射特性，以及催化產(chǎn)物DAB聚合體的暗場(chǎng)散射特性，提高該方法的暗場(chǎng)散射強(qiáng)度。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供的酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及暗場(chǎng)成像中的應(yīng)用。

其中，所述酶標(biāo)抗體-金納米探針(GNP-Ab-HRP)采用以下方法制得：選用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔鼠通用酶標(biāo)二抗構(gòu)建酶標(biāo)抗體-金納米探針(GNP-Ab-HRP)，采用靜電吸附法將鼠兔通用型酶標(biāo)二抗偶聯(lián)到金納米顆粒上，并用1％BSA封閉，離心即得GNP-Ab-HRP探針。

本發(fā)明還提供了一種免疫組化檢測(cè)試劑盒，包括以下組份：

包括彼此獨(dú)立的一抗溶液、酶標(biāo)抗體-金納米探針溶液、DAB顯色液和洗滌液；

所述一抗溶液包括：一抗、防腐劑和磷酸鹽緩沖液(pH＝7-8)；

所述酶標(biāo)抗體-金納米探針溶液包括：10-500μg/ml酶標(biāo)抗體-金納米探針、0.1-5％

封閉蛋白和磷酸鹽緩沖液(pH＝8-10)；

所述DAB顯色液包括彼此獨(dú)立的DAB顯色液Ⅰ、DAB顯色液Ⅱ和1-60％過(guò)氧化氫，使

用前按1:1:1混合；

所述洗滌液包括質(zhì)量百分比為0.01-2％吐溫-20和磷酸鹽緩沖液(pH＝7-8)；

各組分用量如下表：