[發(fā)明專利]酶標(biāo)抗體?金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及暗場成像的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510243543.0
• 申請日: 2015-05-13
• 公開（公告）號: CN104849449B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張宇;范霖;田艷艷;婁豆豆;張熙之;馬明;顧寧
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/574;G01N33/535
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32204
• 代理人: 沈振濤

1.酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及協(xié)同增強(qiáng)暗場成像中的應(yīng)用。

2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述酶標(biāo)抗體-金納米探針(GNP-Ab-HRP)采用以下方法制得：選用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔鼠通用酶標(biāo)二抗構(gòu)建酶標(biāo)抗體-金納米探針(GNP-Ab-HRP)，采用靜電吸附法將鼠兔通用型酶標(biāo)二抗偶聯(lián)到金納米顆粒上，并用1％BSA封閉，離心即得GNP-Ab-HRP探針。

3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述所述酶標(biāo)抗體-金納米探針(GNP-Ab-HRP)的粒徑為10-100nm，每個酶標(biāo)抗體-金納米探針(GNP-Ab-HRP)表面有5-500酶標(biāo)抗體。

4.一種包括權(quán)利要求1至3任一項中所述的酶標(biāo)抗體-金納米探針免疫組化檢測試劑盒，其特征在于：

包括彼此獨(dú)立的一抗溶液、酶標(biāo)抗體-金納米探針溶液、DAB顯色液和洗滌液；

所述一抗溶液包括：一抗、防腐劑和磷酸鹽緩沖液(pH＝7-8)；

所述酶標(biāo)抗體-金納米探針溶液包括：10-500μg/ml酶標(biāo)抗體-金納米探針、0.1-5％封閉蛋白和磷酸鹽緩沖液(pH＝8-10)；

所述DAB顯色液包括彼此獨(dú)立的DAB顯色液Ⅰ、DAB顯色液Ⅱ和1-60％過氧化氫，使用前按1:1:1混合；

所述洗滌液包括質(zhì)量百分比為0.01-2％吐溫-20和磷酸鹽緩沖液(pH＝7-8)；

各組分用量如下表：

試劑 用量 一抗溶液 1-5μl 酶標(biāo)抗體-金納米探針溶液 20-300μl DAB顯色液 50-300μl 洗滌液 100-1000μl/次洗滌

5.權(quán)利要求3所述的免疫組化試劑盒在腫瘤細(xì)胞檢測中的應(yīng)用。

6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：包括以下步驟：

(1)酶標(biāo)抗體-金納米探針的構(gòu)建

選用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔鼠通用酶標(biāo)二抗構(gòu)建酶標(biāo)抗體-金納米探針(GNP-Ab-HRP)，采用靜電吸附法將鼠兔通用型酶標(biāo)二抗偶聯(lián)到金納米顆粒上，并用1％BSA封閉，離心即得GNP-Ab-HRP探針；

(2)暗場免疫組化檢測方法

GNP-Ab-HRP催化DAB顯色，再利用其進(jìn)行雙模態(tài)免疫組化檢測，并實(shí)現(xiàn)量化判讀：將待測樣品按常規(guī)方法預(yù)處理后，先與一抗4℃孵育過夜，再與酶標(biāo)抗體-金納米探針(GNP-Ab-HRP)37℃孵育30min，用PBS-T洗滌后進(jìn)行DAB顯色，在暗場顯微鏡下觀察；

(3)判讀方法及標(biāo)準(zhǔn)

1)對暗場成像圖進(jìn)行取色；

2)分析目標(biāo)顏色面積，計算紅色面積(R)和紅色與黃綠色面積和(S)的比值N；

3)通過將R值和N值和標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間比對，確定目標(biāo)顏色面積處于哪種陰性/陽性區(qū)間；其中，區(qū)間判斷標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)R<400時，為“-”；當(dāng)400<R<10000且N<0.26時，為“+”；當(dāng)400<R<10000且0.26≤N≤0.35時，為“++”；當(dāng)S≥10000且N>0.35時，為“+++”；

4)得出檢測結(jié)論；

5)輸出只含有目標(biāo)顏色的檢測圖片。

7.酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色反應(yīng)中的應(yīng)用。