[發明專利]檢測肝糖原累積癥Ⅰa型GP6C基因突變的試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201510240783.5
• 申請日: 2015-05-13
• 公開（公告）號: CN104862313A
• 公開（公告）日: 2015-08-26
• 發明（設計）人: 劉小龍;劉景豐;黃愛民;魏大海;曾永毅
• 申請（專利權）人: 福州市傳染病醫院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州金道專利代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種檢測肝糖原累積癥Ⅰa型GP6C基因突變的試劑盒，以及利用該試劑盒檢測肝糖原累積癥Ⅰa型GP6C基因突變的方法。

(二)背景技術

糖原累積癥Ⅰ型又稱VonGierke病，簡稱GSDⅠ，是遺傳性肝內葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)先天性缺乏而導致糖原分解或合成障礙的常染色體隱性遺傳性疾病。G6Pase體系主要由4個組分組成：葡萄糖-6-磷酸酶-ɑ(G6PC)、葡萄糖-6-磷酸轉運體(G6PT1)、無機磷酸鹽轉運體(T2)、葡萄糖轉運體(T3)，分別行使葡萄糖-6-磷酸的水解，G6p的轉位，磷酸的運輸和葡萄糖運輸的功能。根據缺陷的酶的不同將GSDⅠ分為4個亞型：G6PC缺陷引起GSDⅠa；G6PTI缺陷引起GSDⅠb；磷酸鹽轉運體缺陷引起GSDⅠc和葡萄糖轉運體缺陷引起GSDⅠd。

研究表明，其中GSDⅠ型約占整個糖原累積癥的25％，而Ⅰ型中Ⅰa型約占80％，故GSDⅠa型是一種相對較為常見的糖原代謝障礙疾病,其活產兒發病率約為十萬分之一。臨床表現主要為低血糖、肝臟腫大、高脂血癥、高尿酸血癥、高乳酸血癥等，主要累及肝臟、腎臟和小腸，在臨床上主要問題表現為診斷率低和診斷手段有限。控制GSDⅠa型的基因為G6PC，該基因定位于G6Pase基因位于人類的17號染色體長臂2區l帶,全長12.5kb，包含5個外顯子。G6PC蛋白為細胞內質網膜蛋白,包含357個氨基酸，為高度疏水性蛋白，有9個跨膜單位,其N端位于內質網腔內,C端位于質膜上。目前國內外學者對GSDⅠa型的基因型研究已確定了多種突變，包括錯義突變、剪接突變、移碼突變、缺失、基因與假基因融合與基因轉化等，具有種族差異性，常見的突變位點為R83C、Q347、R83H、R83C、V338F、D38V、G68R、IVS3-58T>A、IVS4+10G>A。中國人GP6C基因突變等位基因中以R83H及R83C為最常見。

基因測序是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與鳥嘌呤的(G)排列方式。目前常用的Sanger測序法是Frederick?Sanger于1975年發明的，測序過程需要先做一個聚合酶連鎖反應(PCR)。PCR過程中，雙脫氧核糖核苷酸可能隨機的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核苷酸又少了一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續增加長度。最終的結果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。作為一種新型基因檢測技術，基因測序能夠從血液或唾液中分析測定目的基因序列，助力相關遺傳病診斷，可以對那些即使沒有臨床癥狀的患者，也可以得到盡早的診斷和治療，為臨床診治提供科學依據。與患者擁有相同基因型的家族成員，盡管沒有臨床癥狀也應該盡早治療，而臨床癥狀或生化檢查都模棱兩可的家族成員，有可能是雜合子攜帯者需加以關注，具有高度特異且精確，低成本，操作簡便，快速，高通量等優點，是國際上公認的檢測基因突變的“金標準”。

在G6PC基因克隆之前，GSDⅠa的診斷主要靠臨床表現和生化檢查，確診則需要肝穿刺檢測肝標本中G6Pase的活性，對攜帶者無法進行檢查，產前診斷如果對胎兒肝臟進行活檢會給胎兒帶來危險。G6PC基因突變檢測使得以DNA為基礎的基因診斷成為可能，該方法不僅顯著提高了不典型GSDⅠa型病例的診斷率，也是通過產前診斷從而有效降低該病發病率的重要手段。同時對患者的同胞進行基因檢測將有可能將診斷提前至無癥狀的臨床前期，因而對于GSDⅠa型的基因測序檢測，具有更準確、更經濟、更簡便，利于開展，避免了以往該病的診斷有賴于肝穿刺及活檢的診斷方法，更易于被患者接受。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種檢測肝糖原累積癥Ⅰa型GP6C基因突變的試劑盒及方法，用于檢測G6PC基因突變位點，特異性好，靈敏度高。

本發明采用的技術方案是：

檢測肝糖原累積癥Ⅰa型GP6C基因突變的試劑盒，主要包括特異性引物和PCR反應試劑；

所述特異性引物序列如下：

外顯子Exon1擴增引物：

上游引物：5’-AGCAATCACCACCAAGC-3’

下游引物：5’-TCCAAAGTCAGAGAGAGGG-3’；

外顯子Exon2擴增引物：

上游引物：5’-TTCTCAGGCTACACTCTTC-3’

下游引物：5’-CGTGCCTCTCTGGAC-3’；

外顯子Exon3擴增引物：