[發(fā)明專利]基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y的方法及引物組合物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510235864.6
• 申請日: 2015-05-06
• 公開（公告）號: CN104928364A
• 公開（公告）日: 2015-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 段亞冰;周明國;楊瑩;曹君紅;效雪梅;施一淵
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y菌株的方法及引物組合物；可用于禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性群體發(fā)展的動態(tài)監(jiān)測與抗性風(fēng)險評估，進(jìn)行抗藥性小麥赤霉病的流行預(yù)測，為小麥赤霉病的防治提供用藥指導(dǎo)。

背景技術(shù)

由禾谷鐮孢菌(Fusarium?graminearum)引起小麥赤霉病是一種分布較廣、破壞性較強的世界性病害，在小麥的整個生長階段均可發(fā)生，可引起種腐、苗腐、莖腐、稈腐和穗腐，其中以穗腐的危害和損失最大，該病菌能在感病的麥粒中產(chǎn)生多種衍生真菌毒素及次生代謝物質(zhì)，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)和雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)等，嚴(yán)重降低小麥的品質(zhì)，并能引起人類和哺乳動物中毒，發(fā)生腹瀉、頭暈、流產(chǎn)等急性毒性和干擾蛋白質(zhì)合成、免疫功能下降等慢性毒性，嚴(yán)重威脅著人和動物的健康。多年來，小麥赤霉病主要采用以多菌靈為主的苯并咪唑類殺菌劑或以這類藥劑為主的復(fù)配劑進(jìn)行化學(xué)防治。但是隨著使用年限和頻率的增長，田間逐漸產(chǎn)生了抗藥性群體，從而導(dǎo)致該病防效下降。經(jīng)過多年的研究，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)周明國教授課題組發(fā)現(xiàn)小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性主要是由禾谷鐮孢菌β₂-微管蛋白基因(FGSG_06611.3)突變造成，該基因編碼第167位和200位氨基酸密碼子的突變分別為TTT(Phe)→TAT(Tyr)和TTC(Phe)→TAC(Tyr)。

病原菌在自然界的數(shù)量巨大，抗藥性個體在群體中的比例達(dá)到3％時，即可引起抗藥性病害流行，導(dǎo)致藥劑防治失敗。傳統(tǒng)的抗性菌株的檢測方法主要是通過分離培養(yǎng)病原菌，然后在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)藥劑對菌絲生長的抑制作用鑒別抗藥性，該方法檢測周期長，從分離到鑒定長達(dá)1周，甚至數(shù)周，且在病原菌培養(yǎng)過程中存在雜菌污染。近年來，隨著核酸相關(guān)分子檢測技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)為植物病原菌的抗藥性檢測提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，但是檢測需要昂貴的實驗儀器及繁瑣的電泳過程，檢測時間較長，檢測成本高昂，不能滿足快速檢測的需求，并且在鑒定過程中還需要接觸大量有毒有害試劑，對實驗操作人員存在較大的安全隱患。

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)(LAMP)是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸體外擴增技術(shù)，廣泛應(yīng)用于動物、植物等疾病的基因診斷。該技術(shù)原理是：利用一套(4種)特異性引物，在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60～65℃范圍30-80min內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA的同時伴隨有副產(chǎn)物——白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。羥基萘酚藍(lán)(HNB)是一種金屬離子指示劑，根據(jù)反應(yīng)液中鎂離子的變化而呈現(xiàn)出不同的顏色，陰性(沒有擴增出產(chǎn)物)時為紫色，陽性(有產(chǎn)物擴增)時為天藍(lán)色。LAMP方法的最大特點就是實現(xiàn)恒溫擴增，不需要循環(huán)儀、凝膠成像系統(tǒng)等昂貴的儀器；擴增反應(yīng)極快，一般在1小時內(nèi)完成；擴增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，通過肉眼即可判定結(jié)果，不需要繁瑣的電泳過程；靈敏度高、特異性強；操作簡便、快捷，極適于病原突變基因型的快速鑒定及檢測。

本發(fā)明在抗藥性機制研究的基礎(chǔ)上，基于LAMP技術(shù)能快速、準(zhǔn)確鑒定禾谷鐮孢菌對多菌靈的抗性基因型F200Y。該鑒定方法具有簡單、快速、成本低，靈敏性高等特點，能大大提高檢測效率，對小麥赤霉病的抗藥性治理、監(jiān)測及抗藥性流行預(yù)警具有重要的現(xiàn)實意義。然而，經(jīng)檢索，該技術(shù)在植物病原菌抗藥性基因型的檢測報道很少，目前國內(nèi)外尚未有禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y的LAMP快速分子鑒定的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對已有禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性菌株的鑒定方法中存在費時、費力、成本高、準(zhǔn)確性低等缺點及PCR檢測技術(shù)需要昂貴的熱循環(huán)儀器和繁瑣的電泳操作過程，無法快速檢測禾谷鐮孢菌的多菌靈抗性菌株，而提供一種禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y的新穎快速的分子檢測方法，對禾谷鐮孢菌的多菌靈抗性基因型F200Y進(jìn)行LAMP檢測，檢測周期短、準(zhǔn)確性和靈敏度高、肉眼可以直接觀察檢測結(jié)果。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

SEQ?ID?NO.1所示的禾谷鐮孢菌含有200位點突變的β₂-微管蛋白基因序列作為靶標(biāo)在LAMP檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌中的應(yīng)用。