[發明專利]基于環介導恒溫擴增技術檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y的方法及引物組合物

在審

• 申請號: 201510235864.6
• 申請日: 2015-05-06
• 公開（公告）號: CN104928364A
• 公開（公告）日: 2015-09-23
• 發明（設計）人: 段亞冰;周明國;楊瑩;曹君紅;效雪梅;施一淵
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.SEQ?ID?NO.1所示的禾谷鐮孢菌含有200位點突變的β₂-微管蛋白基因序列作為靶標在LAMP檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌中的應用。

2.用于檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP引物組合物：由SEQ?ID?NO.2所示的正向內引物FIP、SEQ?ID?NO.3所示的反向內引物BIP、SEQ?ID?NO.4所示的正向外引物F3、SEQ?ID?NO.5所示的反向外引物B3組成。

3.權利要求2所述的LAMP引物組合物在檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌中的應用。

4.權利要求2所述的LAMP引物組合物在制備多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP檢測試劑盒中的應用。

5.一種檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于含有權利要求2所述的引物組合物。

6.根據權利要求5所述的檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含的檢測溶液為：320U?Bst?DNA聚合酶，20mM?Tris-HCl，10mM?KCl，10mM(NH4)₂SO₄，2mM?MgSO₄，0.1％Triton?X-100，2.5mM?MgCl₂，0.8mM?dNTPs，0.96M甜菜堿，0.2mM羥基溴酚藍(HNB)，1.0μM正向內引物FIP，1.0μM反向內引物BIP，0.25μM正向外引物F3，0.25μM反向外引物B3，加入無菌超純水制備得到。

7.權利要求5所述的檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP試劑盒在檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌中的應用。

8.一種檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP檢測方法，其特征在于取待檢禾谷鐮孢菌的DNA為模板，利用權利要求2所述的引物組合物或權利要求5所述的LAMP檢測試劑盒進行LAMP擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結果，若存在梯狀條帶，則證明所檢測禾谷鐮孢菌為多菌靈抗性基因型F200Y；若無梯狀條帶，則證明所檢測禾谷鐮孢菌為非多菌靈抗性基因型F200Y；或觀察LAMP反應溶液顏色變化，若為天藍色，判定為多菌靈抗性基因型F200Y的禾谷鐮孢菌；若為紫色，判定為非多菌靈抗性基因型F200Y的禾谷鐮孢菌。

9.根據權利要求8所述的檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP檢測方法，其特征在于LAMP反應參數為57～64℃，75～120min。