[發(fā)明專利]一種定量分析微量血干血濾紙片上視黃醇及其前體的方法

有效

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• 申請日: 2015-05-08
• 公開（公告）號: CN104914176B
• 公開（公告）日: 2018-01-02
• 發(fā)明（設計）人: 李廷玉;苗靜琨;鄒琳;余加林;楊亭
• 申請（專利權）人: 重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司50209
• 代理人: 文巍

技術領域

本發(fā)明涉及微量血干血濾紙片中視黃醇及其前體的分析檢測方法。

背景技術

血液中視黃醇均需從動植物食品中攝入，由其前體物質(zhì)：β-胡蘿卜素、視黃醇乙酸酯和視黃醇棕櫚酰酯在腸粘膜和肝細胞中轉(zhuǎn)化形成，共同存在于血液中。只有綜合視黃醇及其前體的含量信息才能全面衡量體內(nèi)視黃醇的水平。

目前，普遍采用用熒光、紫外線分光光度法和高效液相色譜儀(High performance liquid chromatography，HPLC)定量分析血清或血漿中視黃醇，前兩種方法萃取步驟繁瑣，結果受雜質(zhì)影響大；而HPLC法可對血清中復雜組分進行分離，其檢測敏感性與特異性相對較高，但多數(shù)僅開發(fā)了檢測視黃醇的方法，少有分析其多種前體的方法。

此外，以上技術所需靜脈血量均較大，約1-2ml，對于人群則必須抽取靜脈血，對于實驗動物也須取靜脈血，有的甚至需處死后取血，無論對于人群，還是對于動物，其依從性均較差，且標本不便于遠距離運送，這為分析人群和動物模型視黃醇及其前體水平，研究其生理病理功能帶來較大困難。Whatman濾紙片能穩(wěn)定、均一、定量吸附血液，是一款通過美國FDA驗證通過的體外二級診斷用產(chǎn)品。通過采集微量血，吸附于Whatman濾紙片上，形成干血濾紙片，以便于標本的采集、保存和運輸，也可彌補基層或部分缺乏高端檢測儀器及其操作人員的不足而不能分析視黃醇水平，同時已證實視黃醇可穩(wěn)定存在干血濾紙片中。因此，采集微量血制成干血濾紙片是廣泛分析人群和動物模型視黃醇水平的理想標本。然而，這種標本血液標本甚少(約10μL)，且在其中的含量甚微，而傳統(tǒng)HPLC的靈敏度相對低，不能分析。目前國際、國內(nèi)仍缺乏分析利用干血濾紙片定量分析視黃醇及其前體的方法。

串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)儀具有高選擇性、高靈敏度的優(yōu)勢，是近年來飛速發(fā)展的技術，與HPLC對復雜樣品的高分離濃縮、高通量能力的優(yōu)點結合起來，對微量生物樣品多組分同步分析具有突出優(yōu)勢，為解決這一技術難題提供了可能。但文獻中對串聯(lián)質(zhì)譜中分析視黃醇及其前體的各項參數(shù)報道較少，且儀器廠家、型號的差異，導致沒有現(xiàn)成的檢測參數(shù)可以采用，必須根據(jù)本研究單位自己優(yōu)化確定。此外，HPLC對視黃醇及其前體的分離方法的報道也較少，且分析時間較長，約30min，不利于大樣本分析。同時，提取干血濾紙片視黃醇及其前體的方法尤為重要，是能有效檢測的前提，它將影響整個方法的靈敏度。但目前國際、國內(nèi)仍缺乏分析從干血濾紙片中提取視黃醇及其前體的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種定量分析微量血干血濾紙片中視黃醇及其前體的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下措施實現(xiàn)的：

一種檢測視黃醇及其前體的方法，包括以下步驟：

(1)從樣品中萃取視黃醇和/或其前體；

(2)HPLC分離視黃醇和/或其前體；

(3)MS/MS定量檢測；

所述樣品是干血濾紙片標本，采用的萃取劑為三氯甲烷。

上述萃取步驟包括蛋白變性步驟，采用試劑為含有0.1％BHT和0.025mmol/L KOH的甲醇。

上述從樣品中萃取視黃醇和/或其前體包括以下步驟：

①血片溶解：將載有微量血的干血濾紙片用打孔器打出直徑3.2mm(即3.2μl的全血)圓形濾紙血片，置于1.5ml EP管中，加入100μl含0.1％BHT作為抗氧化劑的去離子水，室溫振搖，1000rpm，2min，充分溶解血液；

②蛋白變性：取步驟①所得血斑標本，加入200μl含有0.1％BHT和0.025mmol/L KOH的甲醇變性沉淀蛋白質(zhì)，漩渦震蕩2min；

③萃取：以300μl三氯甲烷作為萃取劑，取步驟②所得的所有溶液，在其中加入萃取劑，室溫振搖2min，離心13200rpm，8min；

④小心吸取含視黃醇、視黃醇乙酸酯、視黃醇棕櫚酰酯、β-胡蘿卜素的有機溶劑層(底層)180μl，氮氣吹干。加入100μl流動相充分溶解。HPLC-MS/MS上機檢測。

上述HPLC分離視黃醇和/或其前體步驟中，采用C8色譜柱，甲醇∶CH₂CL₂＝95∶5(v/v)為流動相，以0.2ml/L等度流速，保持柱溫20℃進行液相分離。

上述MS/MS定量檢測步驟中，以APCI離子源作為離子源，MRM質(zhì)譜檢測參數(shù)采用表1所示。

表1 MS/MS定量檢測優(yōu)化參數(shù)