[發明專利]一種快速檢測地溝油的時間分辨熒光免疫方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201510228234.6
• 申請日: 2015-05-06
• 公開（公告）號: CN104849251B
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 李軍濤;陳守義;朱偉;楊智聰
• 申請（專利權）人: 廣州市疾病預防控制中心
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種快速檢測地溝油的時間分辨熒光免疫方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：優勢菌篩選鑒定：

(1) 地溝油生產原料樣品前處理：選取四份泔水樣品，對每份泔水樣品進行4 個梯度的稀釋，其中加入石蠟和吐溫80 的目的是將油樣乳化為水溶性溶液，具體方法如下: 將泔水樣品原液每2ml 與1ml 石蠟，2ml 吐溫80 及15ml 生理鹽水混合，40℃～ 44℃持續震蕩至混合均勻，之后每毫升樣品加入9 毫升生理鹽水，混合均勻后再每毫升樣品加入9 毫升生理鹽水至混合均勻，備用；

(2) 培養細菌：前處理后，將每個樣品的稀釋前后不同濃度液體分別接種到麥康凱和伊紅亞甲藍兩種培養基，具體方法是取液體100μl 加入到培養基中央，然后用L 型玻璃棒將液體均勻涂布到平板上，做好標記，置于電熱恒溫箱37℃培養，18h ～ 24h 后觀察菌落生長情況，將形態相近的菌落歸類計數，然后挑選出有代表性的不同形態的菌落接種到血平板，編號并標記來源，置37℃ 18h ～ 24h 做純化培養；

(3) 細菌鑒定：將純化培養的菌落，對應每個菌落取相應數量的試管，每管加3.5ml 生理鹽水，用棉簽在血平板上蘸取適量菌溶于管內，控制菌懸液麥氏單位在0.5 ～ 0.63 的范圍內，標記后備用，然后將提前半小時從冰箱取出的GN 卡插到管內，放入VITKE2 全自動微生物鑒定系統，完成裝載和菌種鑒定；

(4) 針對菌種制備特定脂多糖抗體；

步驟二、脂多糖單克隆抗體制備及純化

(1)、樣品收集：將地溝油樣品加入試管中，加入蒸餾水，強烈震蕩，待水油分離時取水相備用；

(2)、間接競爭免疫分析檢測步驟：取脂多糖-BSA 板條，每孔加入50μl 脂多糖標準或上述步驟二(1) 處理好的樣品到各自的微孔中，加緩沖液稀釋的抗脂多糖單克隆抗體50μl，25℃振蕩0.5h，洗滌液洗3 次，沒有連接到固相抗原上的脂多糖抗體在洗滌步驟中被除去，再加分析緩沖液稀釋的Eu³⁺- 羊抗鼠抗體100μl，25℃振蕩0.5h，用洗滌液洗6 次，加200μl增強液振蕩5min 后測量，從標準曲線計算樣品中的脂多糖含量。

2.根據權利要求1 所述的方法，其特征在于，所述步驟二的全部過程在A uto D ELFIA1235 上自動完成。

3.一種快速檢測地溝油的時間分辨熒光免疫試劑盒，其特征在于，該試劑盒是由1、包被有LPS-BSA 的96 或48 孔包被板，2、緩沖液，3、FB1 標準，4、LPS 單克隆抗體凍干品，5、銪標記的羊抗鼠抗體，6、洗滌液，7、增強液所組成；

其中，緩沖液：含8mmol/L NaCl、0.1％ BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L 二乙烯三胺五乙酸、0.1mL/L Tween-80 和0.1％ NaN₃ 的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl 溶液；

6×LPS 標準液：1.0mL/ 瓶，標準液濃度為：0，1.0，10，100，500，1000ng/mL ；

洗滌液：含14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80 和0.2 ％ NaN₃ 的pH7.8、50mmol/LTris-HCl 溶液；

增強液：每升pH3.2 鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15μmolβ- 萘甲酰三氟丙酮，50μmol 三正辛基氧化膦和1mL 曲拉通X-100。

4.根據權利要求3 所述的試劑盒，其特征在于，所述LPS-BSA 活性包被板的制備方法為：包被板包被固相抗原：用pH 9.6、50mmol/LNa₂CO₃-NaHCO₃ 緩沖液將OTA-BSA 稀釋至10mg/L 做為包被液，96 或48 孔微孔板各孔加100μL，4℃放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加150μL 含3g/L BSA 的上述緩沖液封閉，4℃放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存。

5.根據權利要求3 所述的試劑盒，其特征在于，所述銪標記的羊抗鼠抗體的制備方法為：取溶解于pH 7.0、50mmol/L PBS 的5g/L 羊抗鼠抗體1mL，經PD-10 柱轉換緩沖條件，洗脫液為pH 8.5-9.0、含0.155mol/LNaCl 的50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃ 緩沖液，收集蛋白峰，經紫外吸收分析定量，用上述洗脫液稀釋羊抗鼠抗體至2mg/mL，取500-1000μL 稀釋后的羊抗鼠抗體加入含0.2-0.4mg 的Eu³⁺-N₂-[p- 異氰酸- 芐基]- 二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力攪拌反應16h，反應液經用pH7.6、80mmol/L Tris-HCl 緩沖液平衡的1×20cm的Sephadex-G50 柱層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。