[發明專利]基于HER-2/NEU抗原的DC細胞、靶向性免疫細胞群及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201510225509.0
• 申請日: 2015-05-05
• 公開（公告）號: CN104830786A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發明（設計）人: 楊光華;李財新
• 申請（專利權）人: 楊光華
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/87;C12N5/0783;A61K39/00;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種制備DC細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將單核細胞進行第一誘導分化培養，以便獲得未成熟的DC細胞；

利用HER-2/NEU抗原mRNA轉染所述未成熟的DC細胞，以便獲得經過轉染的未成熟DC細胞；以及

將所述經過轉染的未成熟DC細胞進行第二誘導分化培養，以便獲得成熟的DC細胞，

其中，所述單核細胞是從樣本的外周血單個核細胞中分離獲得的。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述HER-2/NEU抗原mRNA是通過以下步驟獲得的：

制備HER-2/NEU抗原cDNA質粒，所述HER-2/NEU抗原cDNA的核酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；

將所述HER-2/NEU抗原cDNA質粒進行線性化處理，以便獲得經過線性化處理的HER-2/NEU抗原cDNA質粒；以及

將所述經過線性化處理的HER-2/NEU抗原cDNA質粒進行體外轉錄，以便獲得HER-2/NEU抗原mRNA。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，以pcDNA3.1載體為骨架載體，制備所述HER-2/NEU抗原cDNA質粒，

任選地，所述pcDNA3.1載體具有BamhI、XbaI和Bst1107I酶切位點，

任選地，基于酶切位點Bst1107I進行所述線性化處理，

任選地，利用T7Message?Machine試劑盒進行所述體外轉錄，

任選地，在進行所述體外轉錄后，進一步包括除雜純化的步驟。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用電轉或PEI法進行所述轉染，

任選地，利用PEI法進行所述轉染，其中，PEI與所述HER-2/NEU抗原mRNA的混合質量比為3:1，

任選地，利用DC培養基進行所述第一誘導分化培養和所述第二誘導分化培養，

任選地，所述DC培養基包含：

無血清細胞培養基；

100～1000U/ml的CTL4因子；以及

2體積％～10體積％的自體血清，

其中，所述血清來源于所述樣本，

任選地，所述無血清培養基為Takara的無血清培養基，

任選地，所述無血清培養基中添加有0.5體積％～5體積％的抗生素，優選慶大霉素，

任選地，進行所述第一誘導分化培養4-5天，每2-3天半換液一次，

任選地，進行所述第二誘導分化培養4-5天，每2-3天半換液一次。

5.一種制備靶向性免疫細胞群的方法，其特征在于，包括以下步驟：

提供樣本的外周血單個核細胞；

將所述樣本的外周血單個核細胞分離為淋巴細胞和單核細胞；

將所述淋巴細胞進行活化培養，以便獲得經過活化培養的淋巴細胞；

將單核細胞進行第一誘導分化培養，以便獲得未成熟的DC細胞；

利用HER-2/NEU抗原mRNA轉染所述未成熟的DC細胞，以便獲得經過轉染的未成熟DC細胞；

將所述經過轉染的未成熟DC細胞進行第二誘導分化培養，以便獲得成熟的DC細胞；以及

將所述成熟的DC細胞與所述經過活化培養的淋巴細胞進行混合培養，以便獲得靶向性免疫細胞群。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述HER-2/NEU抗原mRNA是通過以下步驟獲得的：

制備HER-2/NEU抗原cDNA質粒，所述HER-2/NEU抗原cDNA的核酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；

將所述HER-2/NEU抗原cDNA質粒進行線性化處理，以便獲得經過線性化處理的HER-2/NEU抗原cDNA質粒；以及

將所述經過線性化處理的HER-2/NEU抗原cDNA質粒進行體外轉錄，以便獲得HER-2/NEU抗原mRNA，

任選地，以pcDNA3.1載體為骨架載體，制備所述HER-2/NEU抗原cDNA質粒，

任選地，所述pcDNA3.1載體具有BamhI、XbaI和Bst1107I酶切位點，

任選地，基于酶切位點Bst1107I進行所述線性化處理，

任選地，利用T7Message?Machine試劑盒進行所述體外轉錄，

任選地，在進行所述體外轉錄后，進一步包括除雜純化的步驟。