[發明專利]脂肪原始間充質干細胞的分離方法

有效

• 申請號: 201510219301.8
• 申請日: 2015-04-30
• 公開（公告）號: CN104805055B
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發明（設計）人: 吳炯
• 申請（專利權）人: 廈門中領精準醫學產業發展有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 高之波;鄔玥

本發明公開了一種脂肪原始間充質干細胞的分離方法，采用P型膠原酶消化脂肪組織，離心后獲得脂肪間充質干細胞。P型膠原酶(collagenageP)使脂肪組織消化更徹底，組織消化均一，沒有明顯的組織殘留，得到的間充質干細胞活性好，貼壁快，均一性好。

技術領域

本發明涉及一種脂肪原始間充質干細胞的分離方法。

背景技術

干細胞是一類具有自我更新能力且在適合微環境下具有多系分化潛能的原始細胞。根據個體發育過程中出現的先后次序不同，干細胞可分為胚胎干細胞，多能干細胞以及各種組織中的定向干細胞如造血干細胞、神經干細胞等。目前，已有利用干細胞治療心肌梗塞、紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、神經損傷、肌肉萎縮等的實驗報道。

成體干細胞是存在于人體組織中具有多系分化潛能的一種超能干細胞群，在特定環境下可誘導分化成多種組織細胞。在成體干細胞中，間充質干細胞廣泛存在于全身各種組織中，特別是骨髓，脂肪，臍帶和胎盤。由于脂肪來源的間充質干細胞具有強大的增值能力，較強的分化能力，低免疫原性和免疫調節功能，其在臨床上的應用價值越來越受人們關注。

中國專利ZL201210336264.5公開了一種“人脂肪干細胞的分離培養方法和干細胞庫的構建方法”，該專利中采用I型和IV型膠原酶對脂肪組織進行消化，雖然該方法使得消化效果有所提高，但不能除去大量的雜細胞，需要通過連續傳代來純化細胞，使培養的細胞不利于臨床應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種脂肪組織消化更徹底、明顯提高細胞的純度的脂肪原始間充質干細胞的分離方法。

為實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種脂肪原始間充質干細胞的分離方法，采用P型膠原酶消化脂肪組織，離心后獲得脂肪間充質干細胞。由此，P型膠原酶(collagenageP)使脂肪組織消化更徹底，組織消化均一，沒有明顯的組織殘留，得到的間充質干細胞活性好，貼壁快，均一性好。

在一些實施方式中，P型膠原酶的濃度為0.1～1％(m/v)。由此，采用此濃度的P型膠原酶能夠實現較好的消化效果，獲得質量較高的間充質干細胞。

在一些實施方式中，P型膠原酶的濃度為0.4％(m/v)，消化時間為16min。由此，0.4％的濃度獲得的細胞數量更優，更有利于規?；a。

在一些實施方式中，P型膠原酶母液的配制方法為：100ml生理鹽水加入1gP型膠原酶。由此，采用生理鹽水配制母液操作更加便捷，成本低，且不影響P型膠原酶的活性。

在一些實施方式中，脂肪原始間充質干細胞的分離方法，包括以下步驟：

配制P型膠原酶母液：100ml生理鹽水加入1gP型膠原酶；

獲取脂肪組織：通過腫脹法吸脂手術獲得腹部淺表層的脂肪組織；

消化脂肪組織：加入等體積的0.1～1％(m/v)的P型膠原酶充分混勻，37℃150rpm震蕩消化8～50min；

離心收集：消化產物經過梯度離心后，取離心得到的沉淀即脂肪間充質干細胞。

由此，P型膠原酶對脂肪組織充分消化，經過濾和離心進一步純化細胞，具有步驟簡單、得到的間充質干細胞數量大活性大的特點。

在一些實施方式中，離心收集方法為：消化產物經150目篩網過濾，收集細胞初懸液，將細胞初懸液經1500rpm，10min，1200rpm，10min，1000rpm，10min三次梯度離心后，取離心得到的沉淀即脂肪間充質干細胞。由此，篩網過濾和三梯度離心進一步提高細胞純度。

在一些實施方式中，獲取的脂肪組織維持在2～8°的環境中運輸，12小時內進行分離操作。由此，脂肪組織在上述條件下運輸和操作，能夠保證脂肪組織具有良好的活性。