[發(fā)明專利]一種攜帶KAL基因重組腺相關病毒載體的基因治療藥物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510219195.3
• 申請日: 2015-05-01
• 公開（公告）號: CN104815338A
• 公開（公告）日: 2015-08-05
• 發(fā)明（設計）人: 許瑞安;曲偉紅;崔秀靈
• 申請（專利權）人: 許瑞安
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京華科聯(lián)合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 楊厚;王為

技術領域：

本發(fā)明涉及一種利用重組腺相關病毒載體的基因治療藥物。

背景技術：

目前在我國，肺癌是危害人民健康的惡性腫瘤之一，標準化放、化療治療的肺癌患者，平均生存期為28.7個月，是威脅病人生命的頭號殺手！隨著生物技術的不斷發(fā)展，基因藥物逐漸成為人們關注的一種新治療手段。所說基因藥物，是指利用基因序列數(shù)據(jù)，經(jīng)生物信息學分析、高通量基因表達、高通量功能篩選和體內(nèi)外藥效學研究開發(fā)得到新藥候選物。Kallistatin(KAL)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，能特異性與血漿型激肽釋放酶結合而不與組織型激肽釋放酶結合的蛋白，存在于多種組織和體液中，是人體內(nèi)源性血管生長抑制因子，具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤等作用。目前，多個實驗室開展了KAL的抗腫瘤實驗研究，涉及的腫瘤包括乳腺癌、結腸癌、肝癌、胃癌和肺癌等。雖然已有報道稱，利用kallistatin蛋白或者含有kallistatin基因的質(zhì)粒針對肺部腫瘤的治療，不過，存在半衰期較短、需要短期內(nèi)高劑量持續(xù)給藥等問題困惑，因此迫切需要尋找一種肺癌靶向的、能長效表達的載體，用于攜帶kallistatin基因，更好地發(fā)揮治療肺癌的作用。

為了更好地解決上述問題，本實驗室選用了具有廣泛宿主范圍、能夠介導外源基因長期表達、安全性能好、在人類沒有致病性、可以轉染分裂或者非分裂的哺乳動物細胞并有肺部靶向的9型重組腺相關病毒載體(rAAV9)[Michelfelder,S.等，PLoS?One，2011,6(8)：e23101；Zincarelli,C.等,Mol?Ther,2009,16(6):1073-1080；Bell,C.L.等,J?Clin?Invest,2011,121(6):2427-2435；Walia,J.S.Mol?Ther.2015，,2(3):414-422]。本發(fā)明所述將rAAV9載體攜帶kallistatin的cDNA，腹腔注射到人肺癌荷瘤鼠體內(nèi)，以PBS為陰性對照，以順鉑為陽性對照，觀察49天，發(fā)現(xiàn)rAAV9-KAL能明顯抑制腫瘤的增殖。本發(fā)明提供的治療肺癌基因藥物rAAV9-KAL，迄今尚未見有國內(nèi)外的相關報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供的肺癌治療基因藥物(rAAV9-KAL)，包括以下步驟：

(1)基因重組質(zhì)粒是含kallistatin的cDNA基因，基因表達框兩端為AAV2血清型的末端反向重復序列(inverted?ter?min?al?repeat，ITR)、牛生長激素poly?A元件(bovine?growth?hormone?polyadenylation?signal，BGH?poly?A)，其中還含有氨芐青霉素選擇元件AMP，土撥鼠肝炎轉錄后調(diào)控元素WPRE(Woodchuck?hepatitis?Post-transcriptional?Regulatory?Element)增強子，CAG?chickenβ-actin?promoter啟動子。載體質(zhì)粒是血清型AAV2的rep基因，AAV9的cap基因。

(2)三質(zhì)粒磷酸鈣轉染法生產(chǎn)rAAV9-KAL，采用CHT色譜聯(lián)合ANX色譜進行純化。

(3)建立肺癌荷瘤鼠模型，采用腹腔注射形式進行給藥，每周觀察記錄腫瘤大小，7周后通過腫瘤體積，重量以及kallistatin蛋白表達情況，評價rAAV9-KAL的抗腫瘤效果。

其中：所述肺癌治療用rAAV9-KAL劑量，選自1×10²VG/mL到1×10¹⁶VG/mL的任意一個；給藥途徑適用腹腔注射、靜脈注射、瘤內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、口服等。

本發(fā)明所述的rAAV基因藥物，不僅可以治療移植性肺癌，也可以用于原位肺癌。

本發(fā)明所述的rAAV基因藥物，可以用于肝癌、結腸癌、乳腺癌等腫瘤。

本發(fā)明所述的rAAV基因藥物，不僅適用于rAAV9型載體，也適用于其他血清型載體rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12等。

本發(fā)明所述的rAAV基因藥物，不僅適用于單鏈rAAV載體，也適用于雙鏈rAAV載體。

附圖說明：

圖1.不同血清型rAAV-KAL的體外抗腫瘤作用

圖2.不同給藥途徑的kallistatin蛋白表達量

圖3.不同血清型rAAV-KAL對皮下移植腫瘤作用

圖4.單雙鏈rAAV-KAL抗腫瘤作用