[發明專利]一種高效檢測納米顆粒心肌毒性的方法

有效

• 申請號: 201510214824.3
• 申請日: 2015-04-30
• 公開（公告）號: CN104865348A
• 公開（公告）日: 2015-08-26
• 發明（設計）人: 劉耀文;葉勁松;吳賀君;陳淑娟;何利;李美良;王淑瑤
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: G01N33/00
• 分類號: G01N33/00
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 胡琳梅

技術領域

本發明屬于納米顆粒毒性檢測領域，具體涉及一種高效檢測納米顆粒心肌毒性的方法。

技術背景

在生物醫藥領域，納米顆粒常常用作藥物輸送的載體，在使用納米顆粒時，常需對其毒性進行評價。

心臟是人體的重要器官，一種納米顆粒能否進行生物醫用，其對心臟細胞毒性是重要的考察對象。

在現有技術中，評價納米細胞的心肌毒性的常用方法為進行納米顆粒毒性的動物實驗。然而進行動物實驗，所需檢測周期長，同時常會由于實驗動物的個體差異造成檢測誤差。現有技術中用于替代動物實驗的體外實驗，步驟繁瑣，容易由于操作失誤造成誤差，精確度難以保證。

發明內容

????針對現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種高效檢測納米顆粒心肌毒性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1）制備圖案化纖維電紡接收板：先在絕緣玻璃片上涂覆正性感光膠，再覆蓋一層光掩模，利用光刻機進行刻蝕；再通過直流磁控技術在刻蝕后的玻璃片上沉積一層金屬銀，所沉積的金屬銀的形狀包括正方形、長方形中的一種，邊長的范圍為20?μm-100?μm；最后清洗掉剩余的正性感光膠；

2）制備圖案化電紡纖維：將醫用高分子聚合物用有機溶劑溶解，利用步驟1）所得物作為電紡接收板，通過靜電紡絲技術制備得到正方形或長方形組成的圖案化電紡纖維；控制所得纖維的直徑為100-300?nm；

????所述醫用高分子聚合物包括聚乳酸、聚己內酯、聚氨酯、聚丙烯腈中的一種，所述有機溶劑包括丙酮、二甲基甲酰胺中的至少一種；

????3）將負性環氧樹脂型近紫外線光刻膠SU-8放置在硅片上，利用光刻蝕技術，去掉其余的SU-8，保留寬為40-150μm、高為70-100μm的SU-8長方體作為模具；將熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷卻后，去除模具，得到PDMS腔體；

????4）將步驟2）和步驟3）所得物在O₂?或N₂的氛圍下，用等離子體處理60秒，使得步驟2）和步驟3）所得物緊密連接；

????5）將5×10⁶-1.0×10⁷個小鼠原代心肌細胞接種于步驟4）所得物中的圖案化電紡纖維上，利用注射泵將培養基泵入步驟4）所得物的腔體，流速為0.2-0.3?ml/h；再將納米顆粒懸浮于PBS后泵入,于納米顆粒泵入后，記錄小鼠原代心肌細胞跳動頻率變化、超氧化物歧化酶的酶活、谷胱甘肽過氧化物酶的活性、丙二醛含量、細胞DNA的損傷、細胞凋亡率的變化，得出納米顆粒的毒性；

所述納米顆粒包括納米四氧化三鐵、納米二氧化鈦、納米氧化鋅、納米二氧化硅、納米銀顆粒中的一種。

本發明通過大量的實驗摸索發現，當選用直徑為100-300?nm的電紡纖維，并將纖維膜的圖案設置為正方形或長方形陣列時，以及設置PDMS腔體的尺寸為寬為40-150μm、高為70-100μm時，可使得小鼠原代心肌細胞在腔體內很好的生長，并對納米顆粒產生幾乎與動物實驗相同的毒性反應。

本發明可以使得圖案化纖維和PDMS腔體和玻璃基底無縫緊密貼合，保證了納米顆粒完全的與細胞接觸，確保了檢測的精確度。同時，由于圖案化纖維膜緊密的與基底和腔體貼合，使得本發明可以具有很好的重復操作性，節省了檢測的成本。

重要的是，任何根據本發明作出的可預計的改變，如微調圖案形狀和PDMS大小，均屬于本發明的保護范圍。

特別需要指出的是，本發明適用于檢測納米顆粒的心肌毒性。根據本領域的常識，應理解本發明適用于任何納米顆粒的心肌毒性檢測。應理解本發明所列舉的幾種納米顆粒僅僅用于證明本發明適用于納米顆粒的心肌毒性檢測，不應理解為對本發明的限定。

本發明中，步驟1）沉積的金屬銀可以制備成任何形式的陣列，只需陣列中的圖形為本發明所述的正方形或長方形即可。

優選的，所述步驟1）中沉積的金屬銀的形狀為正方形，邊長的范圍為20?μm-100?μm。當所沉積的金屬銀的形狀為正方形陣列時，原代心肌細胞具有更好的生長狀態，更有利于納米顆粒的心肌毒性的檢測。

所述步驟2）中，進行電紡時，電壓為15-25?KV，流速為0.5-1.0?ml/h。

優選的，所述步驟2）中，纖維的直徑為200?nm。當所用纖維的直徑為200?nm時，原代心肌細胞具有更好的生長狀態，更有利于納米顆粒的心肌毒性的檢測。