[發(fā)明專利]一種采用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜倍性的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510214784.2
• 申請(qǐng)日: 2015-04-29
• 公開（公告）號(hào): CN104878089A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬正林;鄧儉英;武鵬;李立志;周艷霞;劉朝安
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N15/14
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡吉科

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及冬瓜倍性鑒定的方法。

背景技術(shù)

一般而言，進(jìn)行植物倍性鑒定的方法分為兩大類：第一類是直接鑒定法，即染色體計(jì)數(shù)法。這是確定倍性最基本和最精確的方法，但是這種方法需要裝備良好的試驗(yàn)條件和富有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，而且操作過程繁瑣，工作量大，需要消耗大量的時(shí)間來進(jìn)行。第二類是間接鑒定法，其包括田間植株形態(tài)指標(biāo)鑒定、氣孔大小及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目觀察、花粉粒大小判別法等。這些方法比較簡(jiǎn)單，但是不精確，如果植株存在嵌合體時(shí)，無法準(zhǔn)確判斷其倍性。流式細(xì)胞術(shù)是一種簡(jiǎn)單、快捷的對(duì)植株分裂期的核DNA含量進(jìn)行檢測(cè)分析，通過計(jì)算細(xì)胞核DNA含量來分析植株的倍性，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，準(zhǔn)備好的細(xì)胞核樣品在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成測(cè)定和分析,?所以特別適合于樣品較多的倍性檢測(cè)分析。流式細(xì)胞術(shù)是目前植物倍性鑒定最簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的方法。目前在冬瓜倍性檢測(cè)方面還未見有用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定的先例。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明提供一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的鑒定冬瓜倍性的方法，解決染色體計(jì)數(shù)過程中耗時(shí)過多、間接鑒定方法中的不精確性因素的問題。

一種采用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜倍性的方法，包括以下幾個(gè)步驟：

步驟A：?采集幼嫩葉片，將其沖洗滅菌后加入預(yù)冷的改良裂解液，用預(yù)先滅好菌的鋒利刀片將冬瓜葉片切碎；

步驟B：將切碎后的冬瓜葉片用預(yù)先用改良裂解液浸泡過的尼龍濾網(wǎng)過濾到離心管中，再將濾液放入離心機(jī)，室溫下離心，倒掉上清液，加入預(yù)冷的改良裂解液，混勻，再加入染液混勻，避光染色，得到樣品；

步驟C：采用流式細(xì)胞儀的穩(wěn)定性，用熒光微球校準(zhǔn)各熒光通道，確保各熒光通道采集的熒光信號(hào)變異系數(shù)小于2%；選擇已知倍性的二倍體冬瓜為對(duì)照樣品；待測(cè)樣本上機(jī)檢測(cè)，收集4000-5000個(gè)細(xì)胞核，得出樣本流式散點(diǎn)圖與熒光峰圖。

優(yōu)選的，改良裂解液配制：以500-1000m?L為定容，按濃度40-45mmol/L?MgCl₂，25-30?mmol/L檸檬酸鈉，15-20?mmol/L?MOPS，體積濃度為0.1-0.15%的TritonX-100，pH=7.5，配制成所需裂解液，于-20℃保存，解凍后4℃下保存。

優(yōu)選的，所述改良裂解液用DEPC水或去離子水溶解。

優(yōu)選的，所述染液的配制方法：用無菌水溶解DAPI，配制成濃度1?mg/ml的貯存液，配好后用錫紙包起來，避光，可在-20?℃下長(zhǎng)期保存。

優(yōu)選的，所述染液的稀釋方法為：用1xPBS稀釋到濃度為10ug/mL，并用濾網(wǎng)過濾，濾液在4℃下保存待用。

優(yōu)選的，所述濾網(wǎng)采用0.22um，濾液的保存溫度為4℃。

優(yōu)選的，所述尼龍濾網(wǎng)采用300目。

優(yōu)選的，所述二倍體對(duì)照樣設(shè)置在所述流式細(xì)胞儀的100通道。

優(yōu)選的，離心的速度為1000-1500rpm，離心時(shí)間為3-5min。

測(cè)試的具體步驟如下：

a.檢查流式細(xì)胞儀的穩(wěn)定性，打開儀器，預(yù)熱30min。

b.儀器啟動(dòng)后，用熒光微球校準(zhǔn)各熒光通道，確保各熒光通道采集的熒光信號(hào)變異系數(shù)（CV值）小于2%。

c.待測(cè)樣本上機(jī)檢測(cè)，收集4000-5000個(gè)細(xì)胞核，得出樣本流式散點(diǎn)圖與熒光峰圖。數(shù)據(jù)分析為機(jī)器自帶軟件。選擇已知倍性的二倍體冬瓜為對(duì)照樣品，將二倍體對(duì)照設(shè)置在100通道。選用的流式細(xì)胞儀機(jī)器型號(hào)為Cell.?Lab.?Quanta.SC.（美國(guó)貝克曼公司）

本發(fā)明的有益效果是：此方法是用于冬瓜倍性的快速檢測(cè)，選用的改良裂解液是Galbraith’s，染色液為DAPI（10ug/ml）；本發(fā)明樣品制備簡(jiǎn)單，上樣檢測(cè)快速，結(jié)果準(zhǔn)確。從制備樣品至結(jié)果分析完成一個(gè)樣品只需要40min即可完成。

附圖說明

圖1是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜二倍體倍性的熒光光譜圖。

圖2是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜二倍體與四倍體嵌合體的熒光光譜圖。

圖3是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜四倍體的熒光光譜圖。

圖4是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜三倍體的熒光光譜圖。

圖5是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜四倍體與八倍體嵌合體的熒光光譜圖。

圖6是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜六倍體的熒光光譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的較優(yōu)的實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明：

以秋水仙素剝滴誘變處理幼嫩冬瓜幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)2個(gè)月后的黑皮冬瓜幼苗為試驗(yàn)材料，鑒定處理后黑皮冬瓜幼苗的倍性為例：