[發明專利]一種采用流式細胞術快速鑒定冬瓜倍性的方法

在審

• 申請號: 201510214784.2
• 申請日: 2015-04-29
• 公開（公告）號: CN104878089A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發明（設計）人: 萬正林;鄧儉英;武鵬;李立志;周艷霞;劉朝安
• 申請（專利權）人: 廣西現代農業科技示范園
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N15/14
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡吉科

1.一種采用流式細胞術快速鑒定冬瓜倍性的方法，其特征在于，包括以下幾個步驟：

步驟A:?采集幼嫩葉片，將其沖洗滅菌后加入預冷的改良裂解液，用預先滅好菌的鋒利刀片將冬瓜葉片切碎；

步驟B:將切碎后的冬瓜葉片用預先用改良裂解液浸泡過的尼龍濾網過濾到離心管中，再將濾液放入離心機，室溫下離心，倒掉上清液，加入改良裂解液，混勻，再加入稀釋后的染液混勻，避光染色，得到樣品；

步驟C:?采用流式細胞儀的穩定性，用熒光微球校準各熒光通道，確保各熒光通道采集的熒光信號變異系數小于2%；選擇已知倍性的二倍體冬瓜為對照樣品；待測樣本上機檢測，收集4000-5000個細胞核，得出樣本流式散點圖與熒光峰圖。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，改良裂解液配制：以500-1000mL定容，按濃度40-45mmol/L?MgCl₂，25-30?mmol/L檸檬酸鈉，15-20?mmol/L?MOPS，體積濃度為0.1-0.15%的TritonX-100，pH=7.5，配制成所需裂解液，于-20℃保存，解凍后4℃下保存。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述改良裂解液用DEPC水或去離子水溶解。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中，所述染液的配制方法為：用無菌水溶解DAPI，配制成濃度1?mg/ml的貯存液，配好后用錫紙包起來，避光，在-20?℃下長期保存。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中，所述染液的稀釋方法為：用1xPBS將染液稀釋到濃度為10ug/mL，并用濾網過濾，保存待用。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述濾網采用0.22um，濾液的保存溫度為4℃。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中，所述尼龍濾網采用300目。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中，離心的速度為1000-1500rpm，離心時間為3-5min。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C中，所述二倍體對照樣設置在所述流式細胞儀的100通道。