[發明專利]水解酶法測定不對稱二甲基精氨酸及試劑盒

在審

• 申請號: 201510213009.5
• 申請日: 2015-04-30
• 公開（公告）號: CN105424620A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發明（設計）人: 許秀麗
• 申請（專利權）人: 北京丹大生物技術有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物酶法測定不對稱二甲基精氨酸(N^G，N^G’dimethyl-L-arginine，asymmetricdimethylarginine，ADMA)及試劑盒開發。特別地，本發明涉及利用二甲基精氨酸二甲氨基水解酶、鳥氨酸甲氨酰轉移酶、氨甲酰激酶將ADMA轉化為等物質量的氨，進而通過二乙酰一肟-氨基硫脲比色法或谷氨酸脫氫酶速率法測定氨的含量，推知血清中ADMA的濃度的方法和試劑盒。該發明為簡便，準確，靈敏監測不對稱二甲基精氨酸提供了重要依據。

背景技術

不對稱二甲基精氨酸(aN^G，N^G’dimethyl-L-arginine，asymmetricdimethylarginine，，ADMA)，也叫非對稱二甲基精氨酸，分子式見圖1，由Vallance(VallanceP，LeoneA，CalverA，CollierJ，MoncadaS.Lancet339，572-575，1992)1992年首次在血漿和尿液中檢測出ADMA。ADMA由含有精氨酸殘基的蛋白質在蛋白質精氨酸甲基轉移酶(proteinargininemethyltransferases，PRMT)的作用下甲基化，甲基化的蛋白水解后即可釋放出ADMA。ADMA能競爭性抑制一氧化氮合酶(NOS)使一氧化氮(NO)生成減少，在體內起內源性NO合成抑制劑的作用。一氧化氮(N0)是血管衍生中的活性物質，具有舒張血管，維持血管張力恒定和調節血壓的作用。體內多種因素可引起ADMA水平升高，ADMA的蓄積，導致血管內皮功能障礙。已有研究表明，血漿ADMA水平在心血管疾病出現臨床表現之前就已經開始升高。因此，ADMA作為一種前瞻性，獨立的心血管病診斷指標具有重大意義。ADMA水平的升高不僅能作為心血管疾病的先兆，還能作為動脈粥樣硬化，心衰，高血壓，糖尿病，腎衰肝臟衰竭，勃起功能障礙等疾病的一個重要危險因子。

目前，ADMA作為一種新型的內皮功能不全和心血管疾病標志物，引起了國際和國內的廣泛重視。

體內90％ADMA的通過二甲基精酸二甲胺水解酶(dimethylargininedimethylaminohydrolase，DDAH)的分解，分解的產物為胍氨酸和二甲胺或單甲胺(Ogawa，T，andKimoto，M.andSasaoka，K.J.，BiolChem264：10205-9，1989；MacAllister，R.J.andParry，H.andKimoto，M.andOgawa，T.，etal.BrJPharmacol119：1533-40，1996)。

DDAH是一種存在于細胞質的胞內酶。本發明的生物酶法也借鑒了體內ADMA的清除模式，即ADMA在DDAH的水解下，分解為瓜氨酸和二甲胺，作為本試劑盒的第一步反應。

ADMA作為如此重要的一個心血管疾病的指示因子，盡快開發出關于ADMA的診斷試劑應用于臨床，將造福整個社會。測定生物樣品中ADMA濃度的方法，主要有以下幾種，高效液相色譜法，液質聯用法，酶聯免疫法、化學發光法、膠乳增強法以及酶法。

相對來說，高效液相色譜法，液質聯用法由于其操作復雜，儀器要求高，耗資耗時耗力不適合臨床診斷使用。

德國DLDDiagnostikaGmbH公司(DLDDiagnostikaGmbH，Germany)采用競爭的酶聯免疫法測定生物樣品中的ADMA，已經將該試劑盒應用到臨床。但是，該方法主要的技術瓶頸在于ADMA是一個單個氨基酸，目標分子量太小，不能構成一個抗原表位，也決定了通過常規的抗原抗體反應不能將其檢測出來，必須對樣品進行預處理，即乙?；那疤幚聿拍芡ㄟ^酶聯免疫法檢測出來，操作步驟復雜，不利于儀器自動化和標準化。另有專利US20090053741A和CN1656123A(W02003102031-A)并非利用常規免疫結合反應，而是利用一氧化氮合酶法的多肽片段和突變的DDAH酶達到特異性結合的目的，以上均是基于抗原和抗體的免疫學反應而建立的檢測方法，目前為止并未有相應的產品問世。

化學發光和膠乳增強法依據的基本原理與酶聯免疫法相同，也存在同樣的技術瓶頸。最近，CN102328868A公布了一種膠乳增強免疫比濁法檢測不對稱二甲基精氨酸含量試劑盒。該方法通過將抗人ADMA單克隆抗體與交聯有ADMA-人血清白蛋白復合體的膠乳顆粒懸浮液，和樣品中的待檢ADMA競爭結合，通過濁度的下降程度來檢測樣品中ADMA的含量。